原理：

 CCK-8全稱"Cell Counting Kit-8",，是一種基于WST-8的應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測試劑盒,。其工作原理為在電子耦合試劑存在的情況下,，WST-8這一物質(zhì)可以被線粒體脫氫酶還原成橙黃色的甲臜產(chǎn)物，且其顏色深淺與細(xì)胞增殖程度成正比,，與細(xì)胞毒性程度成反比,。

實驗步驟：

 1）制備細(xì)胞懸液：若為懸浮細(xì)胞則直接離心收集對數(shù)生長期的細(xì)胞,；若為貼壁細(xì)胞則用胰酶消化后離心收集細(xì)胞。將收集到的細(xì)胞用含血清培養(yǎng)基重懸后,，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),，再稀釋為5×10^3~5×10^4個/ml的單細(xì)胞懸液。

2）在96孔板中接種細(xì)胞懸液,，每孔100μl,，同時設(shè)計不同的濃度組，每個濃度組可設(shè)計3~6個復(fù)孔,，且設(shè)置好空白組和對照組,。

3）將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h左右（37℃, 5%CO2）。

4）向培養(yǎng)板各孔中加入不同濃度的待測物質(zhì)（藥物,、化學(xué)試劑等）放入培養(yǎng)箱中孵育6~96h,。

6）向每孔中加入10μl CCK-8溶液，加完試劑后輕輕晃動培養(yǎng)板以幫助混勻（防止因CCK8試劑沾在孔壁上而帶來的誤差）,，加樣的過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡,，以免影響OD值讀數(shù)。

7）將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4h,。

8）用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度（OD）。

注意事項:

（1）接種細(xì)胞數(shù)：針對標(biāo)準(zhǔn)96孔板,，貼壁細(xì)胞的最小接種量為1000個/孔 (100μl培養(yǎng)基),。若為白細(xì)胞，接種量不低于2500個/孔 (100μl培養(yǎng)基),。若使用24孔板或6孔板,，應(yīng)預(yù)先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液,。

（2）在細(xì)胞毒性實驗中,，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8,，測定450nm的吸光度作為空白對照,。

（3）在培養(yǎng)箱中孵育期間，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā),，造成體積不準(zhǔn)確,，從而增加誤差，因此,，建議最外一圈的孔只加PBS,，不作為測定孔用。

（4）加入待測物之后培養(yǎng)的具體時間6~96h要看待測物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性,，例如6,、12,、24、48h,。實驗時可以選擇不同作用時間下進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測,。

（5）如果待檢測物質(zhì)有氧化性或還原性，在加入CCK-8之前要更換新鮮培養(yǎng)基,，以去掉待測物質(zhì)的影響,。如果影響比較小或者沒有影響，可以不更換培養(yǎng)基,，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可,。

（6）正常顯色時間為1-4h，可以每半小時測定一次OD值,，使其OD值保持在1-2之間后固定顯色時間重復(fù)實驗,。

（7）因為細(xì)胞種類不同，形成的formazan的量也不一樣,，所以如果顯色不夠的話,，可以延長培養(yǎng)時間，特別是血液細(xì)胞需要較長的顯色時間（5-6h）,。

（8）測定波長：如果樣品為高渾濁度的細(xì)胞懸液,，建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm,，參比波長600-650nm,，建議選650nm。

（9）若暫時不測定OD值,，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,，室溫避光保存， 24h內(nèi)測定OD值不會發(fā)生變化,。

（10）新鮮的CCK-8試劑為粉紅色,，儲存時間過長則顏色加深、效率變低,，最好不使用,。通常情況下CCK-8試劑在0-5℃避光條件下可保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年,。

常見問題

為什么復(fù)孔之間的重復(fù)性不好,？

（1）可能在接種細(xì)胞時不小心帶入了氣泡。為避免這種情況,，應(yīng)及時更換槍頭,，且沿著側(cè)壁將細(xì)胞懸液加入96孔板中，避免槍尖在打液的過程中插入液面下方從而產(chǎn)生氣泡,。若已經(jīng)產(chǎn)生氣泡,，可用1ml注射器針頭燒熱后將氣泡戳破減小誤差,。

（2）可能是在換液過程中將貼壁的細(xì)胞滑散了。為避免這種情況請在細(xì)胞貼壁后注意沿側(cè)壁底面利用槍頭的虹吸作用將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸取出來,。

（3）可能是在換液過程種沒有將孔內(nèi)的液體洗凈就加入了新的培養(yǎng)基,。

（4）可能是加入的CCK-8試劑微量沒有加準(zhǔn)。為避免這種情況,，可以直接配制含10% CCK-8的培養(yǎng)基,，以換液的形式加入96孔板中，每孔100μl,。

計算方法

細(xì)胞抑制率 =（對照-實驗）/（對照-空白）×100%

對照：具有細(xì)胞,、培養(yǎng)基、CCK-8的孔的OD值

實驗：具有細(xì)胞,、培養(yǎng)基,、CCK-8和藥物溶液的孔的OD值

空白：具有培養(yǎng)基和CCK-8的孔的OD值

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