Biozellen®3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠在3D細(xì)胞球體培養(yǎng)試驗(yàn)

時間：2022/2/21閱讀：1916

3D 細(xì)胞球體培養(yǎng)試驗(yàn)步驟：

A,、試劑制備

1、A 基質(zhì)膠：將 A 基質(zhì)膠溶于 37℃水浴槽回溫 10 分鐘,，確認(rèn)*融解.

2,、C 緩沖溶液(1X)制備：使用前將 10X C 緩沖溶液用冰的無細(xì)胞培養(yǎng)液(例如：無血清 DMEM、opt-MEM)制備成 1X C 緩沖溶液,。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .

3,、D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.

B、Biozellen®3D 細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠的制備

全部步驟需要在無菌環(huán)境內(nèi)操作,，操作步驟如下：

1,、將 24 孔培養(yǎng)板放置于冰上預(yù)冷半小時。

2、細(xì)胞計數(shù)后取 2×105~2×107 細(xì)胞與 0.5 毫升 37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)基均勻混合,，并與 0.5 毫升 37℃ A 膠按照 1:1 等比例均勻混合,，最終細(xì)胞密度 1*105~1*107cells/mL。

注：請選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溶液與條件進(jìn)行試驗(yàn),。

3,、取 20-40 微升步驟 2 的混合液滴于步驟 1 預(yù)冷的培養(yǎng)板上，膠體將于 5 分鐘內(nèi)成膠,。注: 測試膠體是否成膠,，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進(jìn)行確認(rèn)。

4,、待膠體成膠后,，添加 1 毫升冰的 1X C 緩沖溶液，并蓋過步驟 3 的膠溶液,，固定 15 分鐘,。

5、待 15 分鐘固定后,，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細(xì)胞生長之培養(yǎng)基溶液,。

6、將含有細(xì)胞的膠于 37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行 7~14 天的培養(yǎng),，并觀察細(xì)胞球體的形成,，按正常培養(yǎng)基更換頻率進(jìn)行更換操作。

C,、溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序

1,、小心的將培養(yǎng)基吸取移除，并用 1X PBS 進(jìn)行清洗,。

2,、小心的將 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的 D 緩沖溶液,，蓋過膠滴于室溫反應(yīng) 5 分鐘,。

3、溫和的用 1 毫升移液管吸取,，直到膠滴*溶解,。

4、將含有細(xì)胞球體的溶液吸入 1.5 毫升離心管,，用 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 10 分鐘，移除上清液體并收集細(xì)胞球體做分析,。

D,、收集單顆細(xì)胞準(zhǔn)備程序

在分離單細(xì)胞前，先按上述溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序進(jìn)行操作

1、添加 trypsin-EDTA 并與收集的細(xì)胞球體于 37°C 混合反應(yīng),。

2,、用 1 毫升移液管混合，直到細(xì)胞體*分解,。

3,、待細(xì)胞球體*分解，加入 3 倍體積的 1X PBS,，并用 1000 轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心 10 分鐘,，并移除上清液體收集沉淀的單細(xì)胞做分析。

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