小鼠皮下成瘤實驗準(zhǔn)備程序
A,、細胞房內(nèi)材料準(zhǔn)備,、試劑制備及步驟
(1) 材料準(zhǔn)備:
1. 冰盒、2. 37 ℃ 水浴槽,、3. C 緩沖溶液(10X),、4. 無血清細胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清 DMEM，DMEM-F12等,，不可用 PBS ),、5. A 膠 (2X)、6. 細胞培養(yǎng)液,、7. 23-26G 針頭,、8. 1 mL 針筒、9. 細胞,。
(2) 試劑制備:
1,、C 緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用 37 ℃ 水浴回溫的無血清細胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清 DMEM 或DMEM-F12 等，不可用 PBS ) 稀釋 C 緩沖溶液 (10 X) 至 C 緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋 20 倍,。使用前放置 37 度水浴槽,。(例如:1 mL C 緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清 DMEM; 若未使用完畢，可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)
2,、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號:B-P-00003-A) 置于37 ℃ 水浴槽回溫10分鐘,，確認*溶解。再將 37 ℃ 水浴回溫的無血清細胞培養(yǎng)液取 0.5 mL，加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mLA膠 (2X),，配置成 1mL 的 A膠 (1X),。使用前置于37度，可降低黏度,。 (單次使用,，勿重復(fù)冷凍解凍 A膠 (1X) )
(3)步驟:
1、取細胞溶液離心后收集細胞沉淀,，與C緩沖溶液 (0.5 X) 均勻混合使細胞濃度為3*106 cells/mL,。
2、A膠 (1X) 與步驟 1 含 C緩沖溶液 (0.5 X) 的細胞系懸浮液,，按照 2:1 比例均勻混合配置,，細胞懸浮液最終濃度為 106 cells/mL。使用前置于37℃,，可降低黏度,。 (C緩沖溶液用于A膠凝膠反應(yīng)，例如0.5ml C緩沖溶液(0.5 X)含細胞 加入 1ml A膠 (1X) 混合成1.5ml 的注射液)
3,、選用 23-26 G 的針頭 (建議選用 24 G) 及 1 mL 針筒,，抽取 步驟2 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液至所需注射體積 (例如:0.2-0.6 mL) 。室溫37℃至20℃操作抽取,。 (若抽取時發(fā)生塞針狀態(tài),，可先把針頭拔掉，以針筒進行抽取,，建議一次抽取配置好所需針筒數(shù)量,，避免步驟2 溶液過度凝膠，發(fā)生塞針)
4,、將抽取好步驟 3 的針筒,，帶入動物房, 若短時間無法施打建議置于冰上。
B,、動物房內(nèi)材料準(zhǔn)備及步驟
(1)材料準(zhǔn)備:
1. 含 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液的針筒,、2. 皮膚消毒劑 (例如 : 酒精)、
3. 手套,、4. 實驗小鼠,、5. 麻醉小鼠的試劑
(2)步驟:
1、室溫下可直接注射,。若是置于冰盒上的針筒,，回到室溫后，待液化再進行注射,。 含 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液的針筒,，以皮下注射方式，注射實驗所需的體積至實驗鼠 (建議皮下注射量為 0.2 mL，實際狀況依需求而定),。(針筒放冰上注射阻力會上升, 放室溫會液化注射阻力小,。注射時若因凝膠緣故而阻力變大，需緩慢注射避免針頭噴落)
注1 : 注射體積可依不同實驗?zāi)康淖稣{(diào)整,，若為皮下血管生成研究注射體積需至少0.5 mL以上,。
注2 : 此步驟依實驗需求可執(zhí)行或不執(zhí)行，若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果,，可調(diào)整2.試劑制備將C緩沖溶液 (10 X) 稀釋15倍，變成C緩沖溶液 (0.66 X),，再執(zhí)行后續(xù)成膠實驗,；提高C濃度，可提高膠體硬度,。
2,、培養(yǎng)一至三周后觀察量測接種的腫瘤尺寸。
注 3 : 若為血管生成研究,，應(yīng)注射含 VEGF 及 heparin 的 A 膠,，以促進血管生成。約三天后,，可摘取含有新血管生成的腫瘤組織,。
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