步驟
一,、實驗步驟
1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠,,經(jīng)75%酒精消毒,斷頭處死。
2. 取腦放入冷的D-Hanks'平衡鹽溶液,去除腦膜及大血管。
3. 分離兩側大腦皮質(zhì)并剪成1mm3 大小,,加入0.25%胰蛋白酶37℃空氣浴震蕩消化10 min。
4. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化,,離心(1 000 rpm,,10 min),去上清,。
5. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀,,經(jīng)75μm篩網(wǎng)過濾,收集濾液,,再次離心10 min,,收集沉淀用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細胞密度至1.5x106/ml,,種植于75 cm2 培養(yǎng)瓶,。
6. 經(jīng)1 小時差速黏附去除成纖維細胞后,將細胞懸液轉移到一新的75 cm2 培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng),,兩天換液一次,。
7. 7 天后將培養(yǎng)瓶放入水平搖床(260 rpm,2 h,,37℃),,換液棄除小膠質(zhì)細胞,放入培養(yǎng)箱平衡1 小時,,重新置于水平搖床18 h,。
8. 換液棄除少突膠質(zhì)細胞,用新鮮培養(yǎng)基洗2 遍,,加入0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA 1:1 混合液消化,、傳代備用,。
二、 形態(tài)學觀察
倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀況,。
三,、 細胞生長曲線繪制
傳代后的細胞以 2x104/ml 的密度種植于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),3 天換液1 次,, 每24 小時取3 孔計數(shù),連續(xù)7 天,,取均值繪制生長曲線,。
四、星型膠質(zhì)細胞的鑒定
膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞組織化學鑒定方法,。取星型膠質(zhì)細胞去除培養(yǎng)基,,用PBS洗3 遍,4%多聚甲醛室溫固定1 小時,,PBS洗3 次,,每次5 分鐘,0.3% H2O2 30 分鐘以去除內(nèi)源性過氧化物,,PBS洗3 次每次5 分鐘,,加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封閉30 分鐘,滴加兔抗GFAP 抗體(1:75),,4℃ 18 小時,,PBS洗3 次每次5 分鐘,滴加生物素標記羊抗兔IgG,,室溫20 分鐘,,PBS洗3 次,每次5 分鐘,,滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,,室溫20 分鐘,PBS洗3 次,,每次5 分鐘,,DAB顯色。
五,、結果
1. 形態(tài)學觀察:光鏡下,,傳代的星型膠質(zhì)細胞折光性強,形狀不規(guī)則,,主要為多角形,,胞體大而扁平、胞質(zhì)豐富,,細胞核圓形或卵圓形,,偏于胞體一側,,內(nèi)有1-2 個核仁,有多個粗短枝狀初級胞突,,部分細胞突起變細變長,,6-7 天后細胞融合成單層,符合神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長特性,,如下圖,。
![](https://img80.chem17.com/9/20211205/637743304334571367144.jpg)
星型膠質(zhì)細胞單層生長(x100)
![](https://img78.chem17.com/9/20211205/637743304335343285218.jpg)
圖1:星型膠質(zhì)細胞形成融合狀,單層生長(x200)
2. 鑒定:細胞經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均為細胞漿著色,,而胞核未見著色,,見下圖,證明采用上述方法獲得的細胞為星型膠質(zhì)細胞,,純度高,, 可用于實驗。
![](https://img78.chem17.com/9/20211205/637743304336123285593.jpg)
圖2:免疫組化鑒定,,GFAP 染色
3. 細胞生長曲線繪制如下:
圖3:細胞生長曲線