步驟

一,、小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)步驟

1.  于無菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1 min,，解剖出完整鼠腦。

2.  預冷解剖液中分離去除軟膜,、血管,、取大腦皮質(zhì)漂洗，用眼科剪將皮質(zhì)反復剪切成碎塊,。

3.  移入培養(yǎng)皿中,，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃培養(yǎng)箱中消化30 min,。

4.  將皮層組織碎塊移入離心管,，棄去剩余消化液，用接種液洗3次,，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底,，棄去上清液。

5.  最后再用接種液1 ml混懸,，反復吹打（巴氏吸管）混懸液中組織塊,，力度適中，至渾濁后將上清液移入培養(yǎng)瓶待用,。

6.  加入1ml接種液后再次吹打,，如此反復3-4次，組織塊逐漸消化后,，棄去最終殘塊,。

7.  收集含單細胞懸液的上清液約4-5 ml于培養(yǎng)瓶中，以接種液重新懸浮細胞,，細胞記數(shù),；接種1x107個細胞于6孔培養(yǎng)板中。

8.  培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后,，換全培養(yǎng)液（DMEM/F12+2%B27）培養(yǎng)3d,，觀察神經(jīng)元生長狀況。

9.  換用阿糖胞苷培養(yǎng)液,、  每隔3d換全培養(yǎng)液1次,，每次換半液。

二,、神經(jīng)元免疫化學鑒定

1.  4%多聚甲醛固定細胞30 min,，PBS洗滌3次,。

2.  加入無水甲醇:30%雙氧水（5:1）處理30 min,，PBS洗滌3次,。

3.  加入5%羊血清封閉20 min,，棄去多余液體。

4.  加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）,，培養(yǎng)箱中孵育2-4 h,，PBS洗滌3次,。

6.  加入DAPI染液（1:40），室溫放置5-10 min,；PBS洗滌3次,。

7.  熒光顯微鏡觀察。 

三,、結(jié)果      

圖1： 剛接種時細胞圖

圖2： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)1d后

圖3： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)2d后

圖4： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)3d后

圖5： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)4d后

圖6： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)5d后

圖7： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)6d后

圖8：第7d免疫鑒定圖