步驟

1) 胚胎的分離。

適用哺乳動(dòng)物（倉(cāng)鼠,、小鼠和大鼠）

a. 采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物,。

b. 立即在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用 70% 乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。若可能,，置紫外燈下照射 5 分鐘,。

c. 用無(wú)菌的鑷了和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無(wú)菌鑷子將皮膚扯向后腿,。

d. 用另一無(wú)菌的剪刀和鑷子切開(kāi)腹部,，取出含有胚胎的子宮，置于無(wú)菌的培蕎皿上,。

e. 剔除胚胎周?chē)陌?，將胚胎放于無(wú)菌的含有無(wú)菌 PBS 的燒瓶中。

f. 漂洗胚胎,，去掉 PBS,。繼續(xù)用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

適用雞胚胎

a. 用 70% 乙醇擦洗雞蛋殼,。

b. 用無(wú)菌剪刀輕敲雞蛋的圓端,，輕輕去除蛋殼露出氣囊。

c. 用無(wú)菌攝子去除覆蓋于絨毛尿囊上的白膜,。

d. 剪開(kāi)包膜,，用彎鑷夾住胚胎頸部取出胚胎。

e. 棄頭部,，將無(wú)頭的胚胎置于廣口燒杯中,，用 PBS 漂洗。

2) 將 6~8 個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)小的無(wú)菌廣口燒杯屮,，用新的無(wú)菌剪刀小心地絞碎胚胎,

用 PBS 漂洗,。

3) 在無(wú)菌狀態(tài)下,，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一 500 ml 的無(wú)菌的有攪拌棒的燒杯中，加人

200~300 ml 用 HBSS 配制的 0.25％ 的無(wú)菌胰蛋白酶（CIBCO/BRL),。

4) 在溫暖的環(huán)境中或置于 37°C 培養(yǎng)箱中輕輕攪動(dòng) 15 分鐘,。

5) 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含冇懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌大容積的離心管中,，該管內(nèi)按照每 10 ml 上清加人 1 ml 牛血清的比例加人牛血淸以滅活胰蛋白酶,。

6) 加人新鮮胰蛋白酶溶液（見(jiàn)前述步驟）于含有殘留未消化組織塊的 500 ml 燒杯中，重復(fù)步驟 4 和 5,。

7) 離心混合的細(xì)胞懸液,，1200r/min，5 分鐘,，棄上清,。

8) 用新鮮的無(wú)菌 PBS 重懸沉淀的細(xì)胞，按步驟 7 再次離心,。

9) 用 PBS 反復(fù)洗滌細(xì)胞至上清清亮為止,。

即用含有 10% 牛血清和抗生素（如青霉素、鏈霉素）的 DMEM(CIBCO/BRL)10 ml 再懸沉淀,，并使終體積為 100 ml,。

11) 讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降。

可采用數(shù)層無(wú)菌紗布過(guò)濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞塊,。

12) 為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度,，加人 0.2 ml 細(xì)胞懸液于 1.8 ml1% 醋酸溶液中以裂解紅細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（見(jiàn)第 2 節(jié)中的"細(xì)胞計(jì)數(shù)")

13) 按每 10 mm 平皿 1x107 至 4x107 細(xì)胞的數(shù)量接種于 10 ml 組織培養(yǎng)液中,，在飽和濕度的 C02 培養(yǎng)箱中孵育直至細(xì)胞鋪滿,。

14) 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后，去除培養(yǎng)液,，用 10% 的溫暖的 Versene（用 PBS 配制的 0.53 mmol/L EDTA,GIBCO/BRL) 洗滌細(xì)胞層 2 次,。

15) 棄 Versene，加人相同體積的溫暖化 0.05% 胰蛋白酶-EDTA(GIBCO/BRL)

16)37°C 孵育 5 分鐘

17) 用無(wú)菌吸管輕輕吹散細(xì)胞,，并轉(zhuǎn)移至一含 1~2 ml 牛血清的無(wú)菌管中,。

18) 離心，1200/min,5 分鐘,，棄上清,。

19) 再懸沉淀于 5 ml 培養(yǎng)液屮（見(jiàn)上文），另加人 15 ml 培養(yǎng)液,，分裝于 2 個(gè) 100 mm 平皿中,。

20) 置 37°C 飽和濕度的 C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿,，繼續(xù)步驟 14~20 以傳代細(xì)胞,。