成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗步驟

時間：2021/11/15閱讀：1494

材料與儀器

骨標(biāo)本
Hams F12 培養(yǎng)液用于細(xì)胞傳代的胰蛋白酶液分離成骨細(xì)胞的消化液
Petri培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶手術(shù)刀手術(shù)鑷

步驟

一,、外植塊培養(yǎng)

1. 從手術(shù)室獲得骨標(biāo)本,。

2. 在室溫條件下，用無菌生理鹽水浸洗骨組織數(shù)次,。

3. 如果骨組織不能及時使用,，將骨標(biāo)本放入含有 12% FBS、青霉素和硫酸鏈霉素的 Ham’s F12 （添加 12 % FBS,、2.3 mmol/L Mg2＋,、100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸鏈霉素）培養(yǎng)液中,。骨標(biāo)本可在 4℃條件下儲存過夜。

4 . 次日早晨,，用含有 100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸鏈霉素的 Tyrode 液浸洗骨組織,。

5. 將骨組織放入 Petri 培養(yǎng)皿，用手術(shù)刀和手術(shù)鑷取骨小梁,，然后將骨小梁移入另一個 Petri 培養(yǎng)皿,。

6. 加入 10 ml Tymde 液，淹蓋切除的骨小梁,。用 Tyrode 液浸洗骨小梁數(shù)次,，直至除去血液和脂肪細(xì)胞。

7. 為了進行植塊培養(yǎng),，將 2 ml *培養(yǎng)液放入 25 cm2 培養(yǎng)瓶,，預(yù)孵育 20 min，以便用培養(yǎng)箱內(nèi)的氣體平衡培養(yǎng)液,。根據(jù)需要,，用 CO2、4.5% NaHCO3 或 HCl 調(diào)整 pH ,。

8. 將骨小梁切成 1~3 mm 小塊,。

9. 吸去培養(yǎng)瓶內(nèi)的預(yù)孵育培養(yǎng)液，然后加入 2.5 ml 新鮮的 Ham's F12培養(yǎng)液,。

10. 將 25~40 塊骨小梁放入培養(yǎng)瓶,。

11. 將培養(yǎng)瓶直立，用接種環(huán)沿著培養(yǎng)瓶底壁滑動植塊,，使植塊均勻分布,。

12. 在 37℃條件下，將培養(yǎng)瓶直立放置 15 min,。

13. 慢慢地使培養(yǎng)瓶恢復(fù)為正常的橫置位,。植塊黏附于培養(yǎng)瓶底壁。

14. 在37℃ 條件下,，將培養(yǎng)瓶橫置 5~7 d。此后,，檢査細(xì)胞長出情況,，換培養(yǎng)液。為了預(yù)防植塊脫離,，在將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱移于超凈工作臺內(nèi)或顯微鏡上之前,，將培養(yǎng)瓶慢慢地直立起來。

15. 每周換培養(yǎng)液 2 次,，以維持培養(yǎng),。

16. 細(xì)胞生長形成單層時，取出植塊，用胰蛋白酶（將 125 mg 胰蛋白酶（XI型,，Sigma）溶入 50 ml 不含 Ca2＋和 Mg2＋的 Tyrode 液,。調(diào)整 pH 至 7.0，過濾除菌,。用 Pyrex 管分裝成 5 ml 和 10 ml,，在 -20℃ 條件下儲藏）消化細(xì)胞。通過離心分離細(xì)胞,，然后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿,。

二、分離細(xì)胞的單層培養(yǎng)

1. 用 Tymde 液反復(fù)沖洗松質(zhì)骨,，洗去脂肪和血細(xì)胞,。在無菌條件下，用手術(shù)刀和手術(shù)鑷切除骨小梁,。

2. 取到較多的骨小梁后,，用 Tyrode 液浸洗 3 次，洗去遺留的血液和脂肪細(xì)胞,。將骨小梁切成 2~5 mm 小塊,。

3. 用含有 FCS 的 F12 培養(yǎng)液洗骨小梁塊。

4. 將組織塊放人盛有磁力攪拌棒的無菌小瓶內(nèi),，然后加入 4 ml 消化液（分離成骨細(xì)胞的消化液：① A 液：含有 8.0 g NaCl,、0.2 g KCl 和 0.05 g NaH2PO4 H2O，用 100 ml 超純水配制,。②B 液（膠原蛋白酶和胰蛋白酶混合液）：將 137 mg 膠原蛋白酶（Ⅰ 型,，Worthington Biochemicals）和 50 mg 胰蛋白酶（Ⅲ，Sigma）溶入 10 ml A 液,。調(diào)整 pH 至 7.2,，然后用超純水配成 100 ml。過濾除菌后,，分裝成 10 ml,，在 -20℃ 條件下儲藏）。加入的消化液應(yīng)淹蓋組織塊,。

5. 在室溫條件下,，將含有組織塊的液體攪拌 45 min。

6. 棄去細(xì)胞懸液,，因為這些細(xì)胞中很可能含有成纖維細(xì)胞,。

7. 加入 4 ml 消化液，在室溫條件下攪拌 30 min,。

8. 收集消化液,，在室溫條件下離心（580 g,，2 min）。

9. 吸去上清液后,，用 4 ml 含有 20 % FCS 的 Ham F12培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,，計數(shù)細(xì)胞。

10. 將細(xì)胞懸液離心（580 g,，10 min）后,，用 4 ml *培養(yǎng)液混懸細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液作為接種物,。

11. 將 75 cm2 培養(yǎng)瓶用 8 ml * F12 培養(yǎng)液預(yù)孵育 20 min,，以便用培養(yǎng)箱內(nèi)的氣體平衡培養(yǎng)液。

12. 吸去預(yù)孵育培養(yǎng)液,，然后加入 2 ml *F12培養(yǎng)液,。

13. 加入 4 ml 細(xì)胞懸液，接種密度為 6000~10000 個/cm2,。

14. 最后加入 6 ml F12培養(yǎng)液,，使總量成為 12 ml。

15. 在分離細(xì)胞期間,，向剩余的骨組織塊加入 4 ml 消化液,，重復(fù)消化 30 min 。

收集分離下來的細(xì)胞,。如有必要,，重復(fù)消化幾次。骨組織多時,，消化時間可延長至 1~3 h ,。每次消化后計數(shù)細(xì)胞，將分離的細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)瓶,。

細(xì)胞傳代

1. 取出植入的組織塊,。

2. 吸去培養(yǎng)液，用 D-PBSA （0.2 ml/cm2）浸洗細(xì)胞,。

3. 向培養(yǎng)瓶加入胰蛋白酶液（0.1 ml/cm2）,，在 37℃ 條件下孵育，直至細(xì)胞脫離瓶壁,，且細(xì)胞彼此分離,。用顯微鏡觀察細(xì)胞的脫離和分離。一般孵育 10 min 即可,。

4. 將分離的細(xì)胞移入離心管,，然后加入等量含有 20% FCS 的 Ham F12 培養(yǎng)液,。

5. 離心（600 g,，5 min）,。

6 . 吸去上清液，用*培養(yǎng)液輕輕混懸細(xì)胞,，反復(fù)吹打,。

7 . 留兩份細(xì)胞份用于確定細(xì)胞密度，另一份用于 DNA 檢測,。

8. 將剩余的細(xì)胞接種于先前用培養(yǎng)液平衡的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿,。細(xì)胞可在 24 h 內(nèi)貼壁。

成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗步驟

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