1. 處死動物后立即切除肌肉,。注意夾持肌腱,，以減少對肌纖維的損傷,。

2. 將肌肉放入 0.2 % Ⅰ型膠原蛋白酶液（W / V,，用 DMEM 配制）,，在 35°C 條件下用搖動水浴箱孵育 60~90 min,。較大肌肉需要較長消化時間,，一般情況下取自 6~8 周大鼠的趾長伸肌需消化 60 min ,。

3. 準備盛肌纖維的 Petri 培養(yǎng)皿,，即用馬血清浸洗培養(yǎng)皿，以免肌纖維黏附于培養(yǎng)皿底壁上,。然后,，加入 20 ml DMEM。

4. 消化后將肌肉移入盛有 DMEM 的 Petri 培養(yǎng)皿,。

5. 在透照立體解剖顯微鏡下,，用改良 Pasteur 吸管（將 Pasteur 吸管割斷，用鉆石筆將開口弄大,。然后,，用火使鋸齒狀邊緣變光滑，以免損傷肌纖維）研磨肌肉,，使單肌纖維分散,。

用 10 % 馬血清（用 DMEM 配制）浸蘸吸管，以免肌纖維黏附吸管,。

6. 肌纖維被分散時,，肌肉的直徑變小。逐漸用口徑小的 Pasteur 吸管,。

7. 當分離 20~30 條肌纖維時,，將肌肉移入另一 Petri 培養(yǎng)皿，繼續(xù)分離,，直至分離得到足夠的肌纖維,。

8. 較大肌肉需要第二次消化，以分散位于中央處的肌纖維,。表淺的肌纖維被分離后,，將剩余的肌肉放人膠原蛋白酶液，進一步消化,。

9. 將肌纖維放入涂有 Matrigel （1 mg/ml,，用 DMEM 配制）的培養(yǎng)皿。

(a)將單肌纖維放于培養(yǎng)皿中央,，讓其貼于 Matrigel。為了培養(yǎng)純單肌纖維,，只放入未損傷的肌纖維,，除去較皺縮部分。這些部分可能有污染的附著細胞,，多為微血管段,；

(b)慢慢加入接種培養(yǎng)液（DMEM，添加 10% 馬血清,、0.5% 雞胚提取液,、4 mmol/L L-谷氨酰胺,、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素），注意勿移動接種的肌纖維,。

10. 將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱,，在 37°C 和 5 % CO2 條件下培養(yǎng)。

增殖

培養(yǎng) 12~24 h 后,，衛(wèi)星細胞開始從肌纖維遷出,。至 3~4 天，每條肌纖維周圍有 50~300 個衛(wèi)星細胞,。確切細胞數(shù)取決于肌纖維來源的肌肉和小鼠周齡等多種因素 [ Bockhold et al.,，1998 ] 。

11. 許多衛(wèi)星細胞從肌纖維遷出時,，用 Pasteur 吸管將肌纖維吸出,。應(yīng)在火焰上將吸管尖部拉細。

12. 繼續(xù)培養(yǎng)剩余的細胞,。

13. 如果需要,，可傳代培養(yǎng)，用增殖培養(yǎng)液（DMEM,，添加 20% FBS,、10% 馬血清、1% 雞胚提取液,、4 mmol/L L-谷氨酰胺,、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）接種細胞。

從骨骼肌分離和培養(yǎng)單肌纖維的方法步驟

材料與儀器

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