一,、分離

1. 用手術(shù)刀切除活檢組織塊上的非肌性組織，然后用 D-PBSA 浸洗,。

2. 稱重前，與肌纖維平行將切除活檢組織切成片,，用沖洗,。

3. 將組織片平行放入 Petri 培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，切成較薄的柱狀組織塊,，然后切成 1 mm3 小塊,。不要擠壓組織。也可在試管內(nèi)用長剪刀將組織剪成小塊,，應(yīng)避免擠壓組織,。

4. 用 D-PBSA 浸洗組織塊，靜置后吸去上清液,。

5. 在 37°C 條件下,，用鏈酶菌蛋白酶液（0.15 % 鏈酶菌蛋白酶（Sigma P-6911）、0.03% EDTA（Merck 8418）,、20 IU/ml 青霉素和 20 μg/ml 鏈霉素（0.4% Eurobio PES3000）,，用 Ham F12 或 D-PBSA 配制，100ml）消化組織塊 1 h,。每 1~3 mg 組織塊用 15 ml 鏈酶菌蛋白酶液,。每間隔 10~15 min 輕輕搖晃試管。

6. 孵育后用吸管研磨組織塊,。由于越來越多的細胞分離下來,，培養(yǎng)液會逐漸變得渾濁。

7. 讓組織塊沉到試管的底部,，形成沉降的組織塊（P1 ) 和上清液（S1）,。

8. 用孔徑為 100 μm 的尼龍網(wǎng)將 S1 濾入 20 ml 離心管。輕輕搖晃或用吸管吹打上清液,，使細胞混懸,。

9. 離心（350 g，8~10 min）后,，吸去上清液,。

10. 準(zhǔn)確加入 10 ml 生長培養(yǎng)液（Ham F12，添加 20 % FBS （Gibco 011-06290），200 ml）,，用帶有橡皮吸頭的吸管很輕微地混懸細胞,。然后，用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞,。

11. 用生長培養(yǎng)液稀釋細胞懸液,，以約 1.5×104 個/ml 的細胞密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶。從 1 g 健康供體活檢組織約獲得 1~2×105個細胞,。

12. 將 15 ml 消化液加入 P1,，在 37°C 水浴中孵育組織塊 30 min，并定時搖晃,。

13. 用吸管吹打細胞懸液,，使細胞分散。然后,，用尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液,。用 20 ml 生長培養(yǎng)液浸洗濾網(wǎng)。

14. 離心（350 g,，8~10 min）后,，計數(shù)細胞，按上述方法接種細胞,。

15. 將培養(yǎng)瓶移入濕潤的培養(yǎng)箱,，在 37°C 和 5 % CO2 的條件下培養(yǎng)細胞。

二,、維持培養(yǎng)

16. 接種后 24 h 很輕微地?fù)Q培養(yǎng)液,，以后每 3~4 d 換液 1 次。細胞主要向著分化生長,。人成肌細胞的生長分 3 期,，培養(yǎng)后 4~6 d 增殖達髙峰；8 d 左右排列成行,；10~12 d 細胞融合和形成肌管增多,。然而，必須記住一些細胞可能分化較早,，絕大多數(shù)細胞分化時一些細胞仍處于增殖狀態(tài),。

三、傳代培養(yǎng)

17. 將少量 EDTA 輕輕注在細胞上面后立即吸去,。

18. 加入 0.25 % 胰蛋白酶液,，足以在細胞上面形成一薄層。

19. 當(dāng)細胞去附著時,，加入 5~10 ml *生長培養(yǎng)液,，用吸管很輕微地吹打細胞,，然后離心（350 g,，10 min）,。

20. 計數(shù)細胞，按一定密度種植細胞,。

從成年骨骼肌分離和培養(yǎng)成肌細胞的方法步驟

材料與儀器

步驟

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