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緩沖液
磁性細胞分離器 分離柱適配器 陽性選擇柱 符合收集容積的收集器 磁性微珠
一,、標(biāo)記
1. 標(biāo)準(zhǔn)方法分離外周血單核細胞或經(jīng)酶消化法及其他方法制備的細胞懸液,。
2. 用 Ficoll-Paque 去除死細胞。
3. 用 30 μm 尼龍網(wǎng)篩或濾膜（Myltenyi,，# 414: 07）過濾細胞去除細胞團塊 （濾膜應(yīng)用前用緩沖液濕潤）,。
4. 緩沖液（D-PBS,，pH 7.2 ,，含 0.5 % BSA 和 2 mmol/L EDTA）洗滌細胞，離心,。
5. 重新懸浮離心細胞,，每 107 個細胞懸浮于 80 μl 緩沖液（80 μl 為最少*，即使總細胞數(shù)低于 107 個）,。
6. 按每 107 個細胞加微珠標(biāo)記液 20 μl,。
7. 混勻，6~12℃ 孵育 15 min (對于更少的細胞,，用同樣體積的微珠標(biāo)記液）,。
8. 加入 10~20 倍于標(biāo)記液體積的緩沖液稀釋細胞。
9. 300 g 離心 10 min,。
10. 去上清,，按每 108 個細胞加緩沖液 500 μl 重新懸浮結(jié)合了微珠的細胞。
二,、陽性磁性分離
11. 將分離柱放入 MACS 分離器（MiniMACS,、MidiMACS、VarioMMMACS,，或 SuperMACS（Miltenyi））的磁性區(qū),。
12. 洗柱：MS＋/ RS＋ 500 μl； LS＋/ VS＋ 3 ml,。
13. 將細胞懸液加人分離柱中：MS＋/ RS＋ 500~1000 μl,； LS＋/ VS＋ 1~10 ml。
14. 讓陰性細胞流過分離柱,。
15. 用緩沖液淋洗柱子： MS＋/ RS＋ 3×500 μl,； LS＋/ VS＋ 3×3 ml。
16. 將分離柱從分離器中取出放置在收集管上,。
17. 用吸管加適量緩沖液于柱中（MS＋/ RS＋ 1 ml,； LS＋/ VS＋ 5 ml）,，推動針管式活塞洗脫陽性標(biāo)記細胞。
18. 細胞計數(shù),，用生長培養(yǎng)基調(diào)整濃度,。
(a)原代培養(yǎng)調(diào)整為1×105~1×106 /ml，接種于培養(yǎng)瓶中,；
(b)克隆培養(yǎng)調(diào)整為 10~1000 /ml,，接種于培養(yǎng)皿。
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