成年大鼠心室肌肉細(xì)胞的分離和培養(yǎng)實驗方法步驟

時間：2021/11/16閱讀：1376

材料與儀器

鼠
KH 緩沖液混合氣體
對流工作臺或?qū)恿魇匠瑑襞_ 乙（酉迷）罩冷凝器循環(huán)水浴和水浴搖床圈型架蠕動泵臺式醫(yī)用離心機(jī) 無菌燒杯 ColorpHast pH 試紙

步驟

一,、ARVM 細(xì)胞分離的準(zhǔn)備工作

1. 準(zhǔn)備如下設(shè)備及器材：

對流工作臺或?qū)恿魇匠瑑襞_

乙（酉迷）罩

冷凝器

循環(huán)水浴和水浴搖床

帶夾的圈型架

免蠕動泵

臺式醫(yī)用離心機(jī)

95% O2 5% CO2 混合氣體

400 ml 無菌燒杯

ColorpHast pH 試紙（精密型）

2. 在對流式或?qū)恿魇焦ぷ髋_中,，裝配 Langedorff 系統(tǒng)，把冷凝器和三通管夾著固定在圈型架上,，管子接上蠕動泵。冷凝器連接 37℃ 循環(huán)水浴，這樣溫水從冷凝器底部流進(jìn)從頂部流回水浴,。

3. 在工作臺的無菌區(qū)域，布置下列無菌器械,，這些可以是高壓滅菌過的或一次性無菌器材：

組織鉗

大號剪刀

彎頭小夾子 2 個

小剪刀

蚊式止血鉗

Swinnex 25 mm 規(guī)格的濾器支架

250 ml 燒杯

玻璃管和硅膠管

帶螺蓋的,，50 ml 錐形瓶,，內(nèi)加小攪拌棒

帶螺蓋的 250 ml 錐形瓶

一次性培養(yǎng)皿，吸管,，60 ml 注射器,，15 ml 和 50 ml 離心管，縫合線

4. 準(zhǔn)備加 CaCl2 和不加 CaCl2 的 Krehs-Henseleit（KH）培養(yǎng)基,，過濾除菌 37℃ 保溫,。

5. 充氧飽和 KH 緩沖液和無鈣 KH 培養(yǎng)基直到 pH 值約 7.4。轉(zhuǎn)移 150 ml 氧飽和的無鈣 KH 緩沖液至無菌的 250 ml 帶螺帽錐形瓶中并置于 37℃ 水浴,。螺帽務(wù)必蓋好,。

6. 制備酶溶液Ⅰ。裝有氧飽和的無鈣 KH 緩沖液的錐形瓶中加 75 mg 的膠原酶和 45 mg 的透明質(zhì)酸酶,。

7. 制備酶溶液Ⅱ,。取 21 ml 溶液Ⅰ轉(zhuǎn)移至一支新管中，加 2 ml 胰酶和 20 μl 無菌 1 mol/L CaCl2 過濾除菌,。膠原酶/透明質(zhì)酸酶溶液移至一無菌的 250 ml 的帶螺帽錐形瓶中,，膠原酶/透明質(zhì)酸酶/胰酶液移至一無菌的 50 ml 帶螺帽錐形瓶中。

8. 往第一個 250 ml 燒杯中加 150 ml KH 緩沖液,，并加入灌注系統(tǒng),，避免產(chǎn)生氣泡。在插管處檢查流過液的 pH 值,，通以 95% O2/5%CO2 氣體將 pH 值調(diào)回 7.4,。流出液體回收到無菌 400 ml 燒杯中。

9. 用預(yù)溫的 KH 緩沖液覆蓋整個平皿底,。

10. 把第一只鼠放進(jìn)乙（酉迷）罩中麻醉,。

11. 把充過氧的無鈣 KH 緩沖液放進(jìn)第二只 250 ml 無菌燒杯中，將流速調(diào)高至 5.5 ml/min,，灌注 6 分鐘,。

12. 酶溶液Ⅰ放進(jìn)第三只 250 ml 燒杯中，泵速度調(diào)節(jié)至 8 ml/min,，灌注 5 分鐘,。把該 250 ml 燒杯放在心臟下面繼續(xù)重新灌注心臟 15 分鐘以上。

二,、解剖動物和灌注心臟

1. 動物*麻醉后,，放在 Langendorff 裝置的附近。動物平躺放置,，用乙醇浸潤胸部剪開胸部皮毛,。

2. 用大剪刀在肋骨下切一橫向切口打開胸腔，然后切開胸膈膜,。

3. 提起劍突,，胸中線兩邊約 2 cm 處沿肋骨各做一條徑向切口,，千萬不要觸及心臟。

4. 用夾子掂起心臟,，剪斷下方的連接,，摘下心臟和胸腺，摘下的心臟放在裝有 KH 溶液的佩特里氏平皿,，然后轉(zhuǎn)到支著灌注設(shè)備的工作臺上,。

5. 把心臟移到平皿的邊緣，提起胸腺露出主動脈,，用小剪刀剪掉胸腺,。

6. 打開泵，流速調(diào)至約每秒一滴,。雙手穩(wěn)握兩把小鉗子，使主動脈沿插套滑動至插套管底部位于心臟的頂部,。

7. 用蚊式止血鉗固定住心臟,，鉗子夾著主動脈底部并保證止血鉗夾著主動脈上端。

8. 在止血鉗下部,，用縫合線牢固地綁住心臟,，灌注 3~5 分鐘使心臟血*排出。

9. 從心臟上剔除殘余組織,，保持肺動脈以及動脈附屬件的完整性,。

三、心臟組織的消化

1. 酶溶液Ⅰ進(jìn)行灌注的最后 2 分鐘時,，用 colorp Hast 試紙檢查液體的 pH 值,，若有必要，通氣調(diào)節(jié) pH 至 7.4,。

2. 從插套管上割下心室并仔細(xì)切成 1 mm2 的小塊,。轉(zhuǎn)入裝有酶溶液Ⅱ 的 50 ml 錐形瓶中，于 37℃ 水浴,，100 r/min 搖動孵育 15 分鐘,。

3. 用 5 ml 吸管稍微吹打上述樣品后轉(zhuǎn)入一支 50 ml 錐形離心管中加 20 ml 洗滌培養(yǎng)基。

4. 一支 60 ml 注射器,，拿掉推桿,，裝上 Swinnex 濾器。往針筒內(nèi)加入細(xì)胞懸液,，把細(xì)胞過濾到一支新管中,。

5. 500 r/min（50 g）離心 30 秒，去上清后,，細(xì)胞重新溶于 10 ml 新的洗滌培養(yǎng)基中,。

6. 讓梭形細(xì)胞沉降 20 分鐘,，小心去上清，用 10 ml 新洗滌培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。

7. 讓細(xì)胞沉降 15 分鐘,，去上清，用 10 ml 洗滌培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。

8. 重復(fù)上述洗滌步驟,，共洗 4 次，最后一次洗滌后,，倒去上清,。加入 5 ml 洗滌培養(yǎng)基。

9. 重懸細(xì)胞后小心鋪放在 DMEM 配制的 6% BSA溶液上層,，讓梭形細(xì)胞沉降 10~15 分鐘,。

10. 最后的細(xì)胞團(tuán)應(yīng)包含高比例的活的梭形心室心臟細(xì)胞。每只心臟若能收到 3X106 個細(xì)胞就很不錯了,。

四,、ARVM 細(xì)胞的培養(yǎng)

1. 在上述細(xì)胞洗滌的同時，準(zhǔn)備包被平板/蓋玻片/載玻片于室溫,，用 10 μg/ml 層黏素溶液浸沒 30 分鐘,。

2. 加入適量的培養(yǎng)皿重懸最后所得的細(xì)胞團(tuán)，并以每只 100 mm 規(guī)格平皿 1X106 個細(xì)胞的量接種至已包被過的平板上,。

3. 讓細(xì)胞貼壁 1 小時,，然后換新的培養(yǎng)基連續(xù)孵育。用加血清或不加血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 1 或 2 周,。

4. 細(xì)胞隔天換液,。

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