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本期介紹設計引物,得到實時熒光PCR引物對,這種方法也可以用于普通PCR,。
1、長度應該在18~30bp,,保證結合的特異性,。
2、熔解溫度(Tm值)應在55~60°C,,兩條引物的Tm值應相差2~3°C,。
3、每條引物3'端應該有1~3個鳥嘌呤或胞嘧啶,,這樣做可以減少PCR過程中的非特異性擴增,。超過3個時會起反作用,發(fā)生“滑動效應"導致錯誤延伸,。
4,、引物的GC含量應該在50%左右,過高的GC含量會升高Tm值,。
5,、引物中應該避免反向重復序列,因為這會形成二級結構,,影響引物結合在模板上,。
6、如果是RT-PCR,,還需要避免設計引物結合在外顯子序列上,,會導致實驗結果假陽性。正確做法應設計在長內含子側翼,、或短內含子上,又或者是跨越外顯子-外顯子交界區(qū),。
7,、對引物進行脫鹽純化,。
需要注意的是,有時候當你做到了所有要點,,引物還是有可能無法擴增,,這時候就要重新設計引物啦。
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