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實(shí)時熒光定量PCR的優(yōu)化（一）

時間：2021/10/12閱讀：2387
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如果是病毒定量和SNP基因分型的實(shí)時熒光定量PCR,，我們需要盡可能高特異性；如果是病原體,、mRNA檢測,，我們需要高靈敏度。


想要提高PCR擴(kuò)增效率,、特異性及靈敏度,，我們可以通過一系列措施優(yōu)化實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。首先是靶序列的選擇,。


1,、選擇的靶序列合適長度在50～150bp之間。較短的序列合成耗時短,，擴(kuò)增時間縮短,，因此污染DNA被擴(kuò)增的可能性降低。

2、選擇靶序列時,，使用BLAST檢索分析靶序列是否存在多態(tài)性和測序錯誤,，并避開。如果靶序列中出現(xiàn)重復(fù)序列,，會降低PCR檢測靈敏度,，也應(yīng)該避開。

3,、控制靶序列中GC含量≤60%,。高GC含量，會影響靶序列在熱循環(huán)中的變性,，也容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,。

4、避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu),。靶序列如果有反向重復(fù)的序列,，容易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，影響引物,、探針的雜交,。

除此以外，我們還需要保證模板的質(zhì)量不會影響擴(kuò)增,，實(shí)時熒光PCR的結(jié)果才有可靠性,。例如損傷的DNA在PCR中不能充分?jǐn)U增，或者根本不能擴(kuò)增,。同時,，如果模板中存在抑制DNA聚合酶的試劑（DMSO等）和污染物（SDS等），也會影響PCR的可靠性,。



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