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實(shí)時熒光定量PCR的優(yōu)化(一)

時間:2021/10/12閱讀:2387
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如果是病毒定量和SNP基因分型的實(shí)時熒光定量PCR,,我們需要盡可能高特異性;如果是病原體,、mRNA檢測,,我們需要高靈敏度。


想要提高PCR擴(kuò)增效率,、特異性及靈敏度,,我們可以通過一系列措施優(yōu)化實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。首先是靶序列的選擇,。


1,、選擇的靶序列合適長度在50~150bp之間。較短的序列合成耗時短,,擴(kuò)增時間縮短,,因此污染DNA被擴(kuò)增的可能性降低。

2、選擇靶序列時,,使用BLAST檢索分析靶序列是否存在多態(tài)性和測序錯誤,,并避開。如果靶序列中出現(xiàn)重復(fù)序列,,會降低PCR檢測靈敏度,,也應(yīng)該避開。

3,、控制靶序列中GC含量≤60%,。高GC含量,會影響靶序列在熱循環(huán)中的變性,,也容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,。

4、避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu),。靶序列如果有反向重復(fù)的序列,,容易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu),影響引物,、探針的雜交,。

除此以外,我們還需要保證模板的質(zhì)量不會影響擴(kuò)增,,實(shí)時熒光PCR的結(jié)果才有可靠性,。例如損傷的DNA在PCR中不能充分?jǐn)U增,或者根本不能擴(kuò)增,。同時,,如果模板中存在抑制DNA聚合酶的試劑(DMSO等)和污染物(SDS等),也會影響PCR的可靠性,。



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