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熒光DNA結(jié)合染料法的缺點是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有DNA雙鏈,,包括在實時熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體,和其他非特異性產(chǎn)物,,引起大量的背景噪聲信號,。
這種噪聲會影響我們對靶基因產(chǎn)量的評估,甚至熒光強度和靶基因的起始量,、全長根本沒什么關(guān)系,。
因此,我們使用熒光DNA染料結(jié)合法時,,需要對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線的分析,。通過對擴增反應(yīng)產(chǎn)物逐漸升溫,同時監(jiān)測每一步的熒光信號來制作熔解曲線,。
熔解曲線的縱坐標是熒光信號值,,橫坐標是溫度值,。通過觀察產(chǎn)生的信號峰和對應(yīng)溫度,可以判斷產(chǎn)物狀態(tài),。
理想情況下,,熔解曲線應(yīng)該是單峰,峰值對應(yīng)溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度,,這才能說明擴增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大,。熒光DNA結(jié)合染料法的缺點是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有DNA雙鏈,包括在實時熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體,,和其他非特異性產(chǎn)物,,引起大量的背景噪聲信號。
這種噪聲會影響我們對靶基因產(chǎn)量的評估,甚至熒光強度和靶基因的起始量,、全長根本沒什么關(guān)系,。
因此,我們使用熒光DNA染料結(jié)合法時,,需要對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線的分析,。通過對擴增反應(yīng)產(chǎn)物逐漸升溫,同時監(jiān)測每一步的熒光信號來制作熔解曲線,。
熔解曲線的縱坐標是熒光信號值,,橫坐標是溫度值。通過觀察產(chǎn)生的信號峰和對應(yīng)溫度,,可以判斷產(chǎn)物狀態(tài),。
理想情況下,熔解曲線應(yīng)該是單峰,,峰值對應(yīng)溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度,,這才能說明擴增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大,。
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