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間充質(zhì)干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞,，可在體外通過不同的方法干預(yù)下下誘導(dǎo)分化為骨、軟骨及其他結(jié)締組織,，因其來源廣泛,，分離無創(chuàng)傷，較低的免疫原性,、生長周期短等特點(diǎn),，是組織工程種子細(xì)胞的重要來源。
干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化一方面是干細(xì)胞鑒定的主要方法,，另一方面也是干細(xì)胞功能學(xué)研究的主要途徑,。采用體外條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下,，人間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)能夠分化為成脂肪、骨,、軟骨細(xì)胞,。成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
試劑：
PBS,，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,，茜素紅
耗材：
NEST細(xì)胞培養(yǎng)皿，NEST普通吸頭,，NEST微量離心管
設(shè)備：
CO2培養(yǎng)箱,，顯微鏡
一、接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,，按照2×105cells/cm2的細(xì)胞密度接種至包被后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)皿放到37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),，定期觀察細(xì)胞增殖狀態(tài),，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)60-70%時(shí)，棄掉上清,，加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,。
二,、細(xì)胞分化誘導(dǎo)
每2-3天進(jìn)行換液（定期觀察是否有污染）,，再放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2-3周,，并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化,。根據(jù)細(xì)胞鈣鹽結(jié)晶析出和鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間,，進(jìn)行下一步染色鑒定,。
三、細(xì)胞固定
用吸頭（確保吸取充分）吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次,，棄去后取適量4%中性甲醛溶液細(xì)胞培養(yǎng)皿底面,，室溫固30-60min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次,。
四,、茜素紅染色
加入適量茜素紅染液染3-5min，吸去茜素紅染液,，用1×PBS清洗兩次,，并加入適量1×PBS避免細(xì)胞干燥。
五,、誘導(dǎo)評(píng)估
顯微鏡下觀察成骨染色效果,，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評(píng)估,。誘導(dǎo)成功時(shí)，鈣質(zhì)結(jié)節(jié)會(huì)與茜素紅染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色,。
圖c 間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化,茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)
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