細(xì)胞消化知多少？

時(shí)間：2021/10/8閱讀：3828

每個(gè)做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的人,，不管去哪“浪",，心里都會(huì)有個(gè)牽掛：我的細(xì)胞，過兩天要傳代,！

大部分組織細(xì)胞離體培養(yǎng)時(shí),，會(huì)以貼壁的形式生長(zhǎng)（除了取自血、脾或骨髓的細(xì)胞）;*培養(yǎng)基中的血清,，含有許多帶陽(yáng)性電荷的促細(xì)胞附著因子（層黏連蛋白 Laminine,、纖維鏈接蛋白 Fibronectin 等胞外基質(zhì)），能幫助細(xì)胞附著于帶陰性電荷的底物上（玻璃或塑料培養(yǎng)容器）,，并形成鍵結(jié),、貼壁伸展,。

細(xì)胞消化知多少,？

▲ 陽(yáng)性電荷的促細(xì)胞附著因子,，能幫助細(xì)胞附著于帶陰性電荷的底物上

所以當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿需要分盤的時(shí)后，就要想辦法讓細(xì)胞和培養(yǎng)底物說再見,！也就是所謂的細(xì)胞消化（Cell Detachment）,。

常見細(xì)胞消化法有以下三種：

1、物理機(jī)械法

直接用液體吹打或用刮刀,，施予外力讓細(xì)胞與培養(yǎng)底物分離,；適用于貼壁性弱的細(xì)胞傳代，但相較于其它消化方法,，這種外力無法量化控制,，細(xì)胞分散效果差，且可能會(huì)造成大量細(xì)胞破損,，使內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基,，進(jìn)而影響細(xì)胞傳代狀態(tài)。

細(xì)胞消化知多少,？

▲細(xì)胞刮勺

2、離子螯合法

細(xì)胞膜表面蛋白大多需要鈣,、鎂離子來維持與胞外基質(zhì)的穩(wěn)定鍵結(jié),，當(dāng)然也包含各種黏附蛋白（例：整合素、鈣黏著蛋白,、橋粒等）,，螯合劑會(huì)在不破壞細(xì)胞膜表面蛋白的狀況下，抽離這些離子,，使黏附蛋白失活而減少細(xì)胞-細(xì)胞間及細(xì)胞-底物間的連接作用,，讓細(xì)胞較容易在施予外力時(shí)，脫離培養(yǎng)底物并促進(jìn)細(xì)胞分散,。

0.02% EDTA是細(xì)胞傳代較為常用的離子螯合劑,，在37℃作用效果較為佳（消化較敏感的細(xì)胞可在4℃作用），適用于消化一般貼壁性細(xì)胞或細(xì)胞表面標(biāo)記實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,。

但EDTA無法用血清終止其反應(yīng),，所以在消化細(xì)胞后必須用緩沖鹽溶液（如：PBS）清洗離心，以免影響后續(xù)細(xì)胞貼盤效果,。

細(xì)胞消化知多少,？

▲ EDTA（黑）能螯合二價(jià)離子（紅）

3,、酶消化法

用蛋白水解酶消化連接細(xì)胞及培養(yǎng)底物的蛋白質(zhì),，適用于消化貼壁性稍強(qiáng)的細(xì)胞。

（１）胰蛋白酶（Trypsin）

為一種來自于胰腺的絲氨酸蛋白酶,；能辨識(shí)并剪切勝肽鏈中的賴氨酸（Lys）和精氨酸（?Arg）羧基端（兩者之一緊跟脯氨酸狀況除外）,，所以能直接作用在細(xì)胞外的黏附蛋白及胞外基質(zhì)上，但如果作用時(shí)間過長(zhǎng),，細(xì)胞膜上內(nèi)嵌的其他蛋白也會(huì)被水解,，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損；不同細(xì)胞適合的胰蛋白酶使用濃度及作用時(shí)間都各有不同,。

使用胰蛋白酶消化前,，請(qǐng)先用不含鈣、鎂離子的平衡鹽溶液清洗細(xì)胞,，因?yàn)檠逯械目鼓窱II及平衡鹽溶液中的鈣,、鎂離子，都會(huì)降低胰蛋白酶活性,，導(dǎo)致消化效果不佳,；消化完畢后，可直接用含血清的培養(yǎng)基或其他胰蛋白酶抑制劑終止消化反應(yīng),。

（２）膠原酶（Collagenase）

為一種膠原水解酶,，大多由細(xì)菌提取而來；能辨識(shí)并剪切Pro-X-Gly-Pro勝肽序列,，而此序列在胞外基質(zhì)主成分-膠原蛋白中出現(xiàn)的頻率比一般蛋白高很多,，使得膠原酶能較專一的作用在胞外基質(zhì)上，所以對(duì)細(xì)胞的傷害比胰蛋白酶小,，且在鈣,、鎂離子環(huán)境中仍有活性，可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,，操作簡(jiǎn)便,，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本,。

細(xì)胞還是不愿意跟底物說再見,！咋辦？

面對(duì)貼壁性*的細(xì)胞,，可進(jìn)一步使用含EDTA的胰蛋白酶來消化細(xì)胞,，EDTA會(huì)抓住細(xì)胞表面未洗凈的鈣、鎂離子,，降低黏附蛋白活性使細(xì)胞不會(huì)彼此粘黏,，同時(shí)讓胰蛋白酶在不受鈣、鎂離子干擾下發(fā)揮最大作用剪切胞外基質(zhì)及黏附蛋白,，讓細(xì)胞順利脫離培養(yǎng)底物且減少細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象,。

細(xì)胞消化小技巧

不一定要一次把所有細(xì)胞都要消化下來,！

晃動(dòng)培養(yǎng)盤并在顯微鏡下用肉眼觀察，只要70~80%細(xì)胞都收縮了或超過適合消化時(shí)間,，就該終止消化反應(yīng),，如果細(xì)胞量夠即可進(jìn)行后續(xù)傳代或?qū)嶒?yàn)步驟；如果細(xì)胞量不夠,，則可視情況用不含鈣,、鎂離子的平衡鹽溶液清洗仍貼壁的細(xì)胞，再進(jìn)行一次消化反應(yīng),。細(xì)胞消化知多少？

▲ 消化不下來的細(xì)胞（黃）請(qǐng)視情況決定是否再消化一次,。

不一定要吹打成*單細(xì)胞懸液,！

一般細(xì)胞脫離培養(yǎng)底物、并經(jīng)過5~10次輕柔吹打后,，會(huì)在細(xì)胞懸液里形成小規(guī)模聚集(約5~10顆細(xì)胞),，所以不需要過度延長(zhǎng)消化時(shí)間想讓細(xì)胞*分離成單細(xì)胞懸液

消化效果不佳，先提升消化液濃度,、再加長(zhǎng)作用時(shí)間,！

當(dāng)你選定了一種消化方式 (物理機(jī)械法除外)，發(fā)現(xiàn)效果不佳,，首先應(yīng)考慮提高EDTA或胰酶濃度,，效果再不佳才加長(zhǎng)消化的作用時(shí)間，避免細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間浸泡在消化液中造成的細(xì)胞膜損傷,。

（一般消化液使用：0.02%~0.04% EDTA作用5-20分鐘,；0.2~0.5% 胰蛋白酶作用1~5分鐘）

結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞消化，是一個(gè)看似很簡(jiǎn)單,，但是有很多技術(shù)含量的步驟,。消化好壞、是否污染,、有無受傷,，都在這短短的五六分鐘里決定。

當(dāng)我們已經(jīng)可以順利操作細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),，接下來要思考的,，就是如何讓細(xì)胞長(zhǎng)得更健康、更均一,、做出來的實(shí)驗(yàn)才會(huì)更好,。

祝各位的細(xì)胞都顆顆透亮、粒粒分明,、活力旺盛,！

細(xì)胞消化知多少？

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