轉(zhuǎn)染 ,，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù),。隨著基因與蛋白功能研究的深入,，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法,。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo),、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例,； 化學(xué)介導(dǎo)方法很多,，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的 技術(shù),；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高,、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn),。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率高的方法,，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì),。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性,，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,，則各有其特點(diǎn),。 需要指出的一點(diǎn)，無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù),，要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果,，可能都需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件 進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多,，從細(xì)胞類型,、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，到轉(zhuǎn)染 方法的操作細(xì)節(jié),，都需要考慮,。 

一、細(xì)胞傳代 

1. 試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip 頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),，酒精棉球,，廢液缸，試管架,，微量移液器,，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿,，離心管,。 

2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,，用 1ml 的 PBS 溶液洗滌兩次。 

3. 用 Tip 頭加入 1ml Trypsin 液,，消化 1 分鐘(37℃,，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,，觀察到細(xì)胞*從壁上脫落下來為止,。 

4. 加入 1ml 的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。 

5. 用 Tip 頭多次吹吸,，使細(xì)胞*分散開,。

6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm 離心 5min,。 

7. 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇 0.8X106 個(gè)細(xì)胞加入一個(gè) 35mm 培養(yǎng)皿。 

8. 將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中,，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中,，使其均勻分布。 

9. 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，第二天轉(zhuǎn)染,。 

二,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染 

1. 轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備 

① 將 400ul 去核酸酶水加入管中,，震蕩 10 秒鐘，溶解脂狀物,。 

② 震蕩后將試劑放在－20 攝氏度保存,，使用前還需震蕩。 

2. 選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA 質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基,。加入合適質(zhì)量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,，再次震蕩,。 

3. 將混合液在室溫放置 10―15 分鐘。 

4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用 PBS 或者無血清培養(yǎng)基清洗一次,。 

5. 加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí),。 

6. 到時(shí)后,，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24－48 小 時(shí),。 

三,、第二次細(xì)胞傳代 

1. 在轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。 

2. 再次進(jìn)行細(xì)胞傳代,，按照免疫染色合適的密度 0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm 培養(yǎng)皿將細(xì)胞重 新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中,。 

3. 在正常條件下培養(yǎng) 24 小時(shí)后按照染色要求條件固定。

四,、各種轉(zhuǎn)染方法比較

1,、DEAE－葡聚糖法：其原理是帶正電的 DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。主要應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,。特點(diǎn)是相對(duì)簡(jiǎn)便,、重復(fù)比磷酸鈣好，但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用,，轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清且一般只用于 BSC-1,，CV-1， COS 細(xì)胞系,。

2,、磷酸鈣法：其原理是磷酸鈣 DNA 復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,、染瞬轉(zhuǎn)染,。特點(diǎn)是不適用于原代細(xì)胞（所需的 DNA 濃度較高），操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差,，有些細(xì)胞不適用細(xì)胞建議用 CSCL 梯度離心,，轉(zhuǎn)染是拷貝數(shù)較多。

3,、陽離子脂質(zhì)體法：其原理是帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物,，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過細(xì)胞是內(nèi)吞作用而被進(jìn)入細(xì)胞,。(若 DNA 濃度過高,，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細(xì)胞的結(jié)合能力),。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、 所有細(xì)胞,。特點(diǎn)是使用方法簡(jiǎn)單,，可攜帶大片段 DNA，通用于各種類型的裸露 DNA 或 RNA,，能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞,， 沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率,，但在體內(nèi),，能被血清清除,，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng),，導(dǎo)致高水平的毒性,，這在很大程度上限制了其應(yīng)用。

4,、陽離子聚合物：其原理是帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用,，并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,、 所有細(xì)胞。特點(diǎn)是除了具有陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高,，操作簡(jiǎn)單,，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外,，還具有在體內(nèi),，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn),，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑,。

5、逆轉(zhuǎn)錄病毒 (RNA)：其原理是通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞,，之后反轉(zhuǎn)入酶啟 動(dòng)合成 DNA 并隨機(jī)整合到宿主基因組中,。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、特定宿主細(xì)胞,。特點(diǎn)是可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,、原代細(xì)胞， 體內(nèi)細(xì)胞等,，但攜帶基因不能太大 （<8kb），細(xì)胞需處分裂期,，需考慮安全因素,。

6、腺病毒(雙鏈 DNA)：其原理是先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合,，繼而在 αv 整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞,。主要應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、特定宿主細(xì)胞,。特點(diǎn)是可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,，需考慮安全因素。

7,、Biolistic  顆粒傳遞法 （基因槍粒子轟擊法）：其原理是將 DNA 用顯微重金屬顆粒沉淀,，再將包被好的顆粒用彈道 裝置投射入細(xì)胞,，DNA 在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá),。主要應(yīng)用于瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染,、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。特點(diǎn)是可用于人的表皮細(xì)胞,，纖維原細(xì)胞,，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞。

8,、顯微注射法：其原理是用顯微操作將 DNA 直接注入靶細(xì)胞核,。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,。特點(diǎn)是轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞。

9,、電穿孔法：其原理是高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位,， DNA 通過膜上形成的小孔導(dǎo)入。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,、所有細(xì)胞。特點(diǎn)是適用性廣,，除了質(zhì)粒外,，還可轉(zhuǎn)染大的基因組（>65kb）但細(xì)胞致死率高，DNA 和細(xì)胞用量大,， 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件,，拷貝數(shù)較少 1-20。