一些真核蛋白在原核宿主細胞中的表達不但行之有效而且成本低廉,，然而許多在細菌中合成的真核蛋白或因折疊方式不正確,，或因折疊效率低下,，結(jié)果使得蛋白活性低或無活性,。不僅如此,，真核生物蛋白的活性往往需要翻譯后加工，例如二硫鍵的精確形成,、糖基化、磷酸化,、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進行的裂解等等,，而這些加工原核細胞則無能為力。 需要表達具有生物學(xué)功能的膜蛋白或分泌性蛋白,，例如位于細胞膜表面的受體或細胞外的激素和酶,，則更需要使用真核轉(zhuǎn)染技術(shù)。由于 DNA 導(dǎo)入哺乳動物細胞有關(guān)技術(shù)方法的發(fā)展,，使真核表達成為可能,。

利用克隆化的真核基因在哺乳動物細胞中表達蛋白質(zhì)，具有以下多種不同用途：

(1) 通過對所編碼的蛋白質(zhì)進行免疫學(xué)檢測或生物活性測定,，確證所克隆的基因,。

(2) 對所編碼的蛋白質(zhì)須進行糖基化或蛋白酶水解等翻譯后加工的基因進行表達。

(3) 大量生產(chǎn)從自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白,。 

(4) 研究在各種不同類型細胞中表達的蛋白質(zhì)的生物合成以及在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的情況,。 

(5) 通過分析正常蛋白質(zhì)及其突變體的特性，闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,。 

(6) 使帶有內(nèi)含子而不能在原核生物如酵母中正確轉(zhuǎn)錄為 mRNA 的基因組序列得到表達,。 

(7) 揭示某些與基因表達調(diào)控有關(guān)的 DNA 序列元件。

DNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)現(xiàn)已變成研究基因功能和組分的重要工具,，已發(fā)展了很多轉(zhuǎn)染方法,，并成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)染各種細胞。目前廣泛應(yīng)用方法有磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法,、病毒載體,，以及陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法。進行真核轉(zhuǎn)染的一般程序： 克隆目的基因(經(jīng)測序驗證)-準(zhǔn)備真核表達載體-將目的基因插入表達載體中-轉(zhuǎn)染-篩選-鑒定,。

下面以 pcDNA3 為載體,，p16 為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實驗操作,。 

一,、試劑準(zhǔn)備 

1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl 溶于 90ml ddH2O,，加入 1M Hepes, 調(diào) pH 到 7.4,補 ddH2O 至 100ml, pH7.4,，濾過除菌。 

2,、核酸貯存液,，過濾除菌。 

3,、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的,，用于轉(zhuǎn)染細胞的正常培養(yǎng)。

二,、操作步驟 

(一)克隆目的基因 

1,、根據(jù) GenBank 檢索的目的基因序列，設(shè)計擴增引物,，并在上,、下游引物的 5’-端分別 引入酶切位點 BamHⅠ和 XhoⅠ，行 RT-PCR,。 

2,、回收特異性擴增片段，連入 T 載體,。 

3,、轉(zhuǎn)化 DH5α，質(zhì)粒制備,。 

4,、酶切初步鑒定，測序證實,。

(二) 真核重組表達載體的構(gòu)建： 

pcDNA3 載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列,、便于挑選帶重組質(zhì)粒細菌的抗生素抗性基因，以及表達外源 DNA 序列所必需的所有真核表達組件,。

重組質(zhì)粒與 pcDNA3 分別用 BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切 

回收插入片段和 pcDNA3 線性片段 

T4 連接酶連接 

轉(zhuǎn)化 DH5α 

質(zhì)粒制備 

BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切鑒定,。

(三)重組 pcDNA3 轉(zhuǎn)染 SHG-44 細胞： 

1,、G418 篩選濃度測定：SHG-44 培養(yǎng)于 24 孔培養(yǎng)板→G418 分別用 100mg/L、200mg/L,、 300mg/L,、400mg/L、500mg/L,、600mg/L 加入,，各濃度 3 復(fù)孔，設(shè)正常對照 3 復(fù)孔,。 以 10-14 天細胞全部死亡的濃度為篩選濃度,，結(jié)果為 200mg/L。 

2,、在轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞,，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而 定。進行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細胞應(yīng)達到 60%-80%覆蓋,。一般要求,，6 孔培養(yǎng)皿(35mm)，每孔 1-2ml 培養(yǎng)基 3×105 細胞,。依據(jù)不同大小培養(yǎng)板調(diào)整每平方厘米的細胞數(shù)量,。

3、 SHG-44 細胞的轉(zhuǎn)染： 

(1) 轉(zhuǎn)染當(dāng)天,，加入脂質(zhì)體/ DNA 混合物之前的短時間內(nèi),，更換 1ml 新鮮的有血清或無血清培養(yǎng)基。 

(2) 準(zhǔn)備不同比例的 DOSPER/ DNA 混合物,，以確定每個細胞系的最佳比例。① 溶液 A： 用 HBS 稀釋 DNA(pcDNA3,、重組 pcDNA3)各 1.5μg 到總體積 50μl(30μg/ml),。②溶液 B：用 HBS 稀釋 6μl 脂質(zhì)體到終容積 50μl(120μg/ml)。③混合溶液 A 和 B,，輕柔混合(不要振蕩),，室溫孵育 15min，以便脂質(zhì)體/DNA 混合物形成,。 

(3) 不要移去培養(yǎng)基,，逐滴加入 100μl 脂質(zhì)體/DNA 混合物(從培養(yǎng)孔一邊到另一邊)，邊加邊輕搖培養(yǎng)板,。 

(4) 37℃孵育 6hr,。 

(5) 6hr 后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入 2-3ml 新鮮生長培養(yǎng)基,。 

(6) 轉(zhuǎn)染 24hr 后施加篩選壓力,，改用含 G418 的培養(yǎng)基培養(yǎng),。

4、 G418 篩選：在 G418 篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng) 14 天后,，挑出單克隆,，擴大培養(yǎng)，同時轉(zhuǎn)染 pcDNA3 即 SHG-44-vect,，并設(shè)對照組細胞即 SHG-44,。

(一)篩選結(jié)果鑒定： 

(1)基因組 DNA 提取→PCR 鑒定外源基因 

(2)SHG-44-重組 pcDNA3 陽性細胞、SHG-44-vect 裂解 聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡 鑒定 P16 蛋白表達(Western-blot),。 

(3)測定外源性基因?qū)?SHG-44 細胞增殖的影響

①流式細胞儀分析：SHG-44,、SHG-44-vect、SHG-44-重組 pcDNA3→單細胞懸液→70% 酒精固定→裂解細胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機分析 G1 期和 G2/M,、S 期比例,。 

②細胞生長曲線測定：SHG-44、SHG-44-vect,、SHG-44-重組 pcDNA3→5×104/孔接種 24 孔培養(yǎng)板→24hr 后各自用苔盼藍染色計數(shù)細胞→計算細胞生長抑制百分率,。 

③軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect,、SHG-44-重組 pcDNA3→104 細胞 →0.3%低熔點瓊脂糖培養(yǎng)→1-2周后計數(shù)不可少于50個細胞的克隆數(shù)→計算克隆形成率抑制率,。

三、注意事項 

1,、優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件(脂質(zhì)體的用量,、DNA 密度、細胞密度,、脂質(zhì)體和 DNA 混合孵育時間)每 種細胞和質(zhì)粒均須進行,。用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。為避免微生物污染,，所用溶液濾過滅菌,，以及隨后的使用應(yīng)在無菌條件下，這是細胞慣常的做法,。但是,，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA 混合物無需濾過除菌。 

2,、預(yù)備脂質(zhì)體/DNA 混合物必須在無血清下進行,。但是在隨后的脂質(zhì)體/ DNA 與被轉(zhuǎn)染細胞共孵育的過程中，血清又是培養(yǎng)基的一部分,。 

3,、在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率,，但所用培養(yǎng)基必須 37℃預(yù)溫,。 脂質(zhì)體/ DNA 混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入,，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿一邊到另一邊,，邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿,，以確保均勻分布和避免局部高濃度。