PCR、qRT-PCR 最最初始，都離不開 RNA 的抽提,，RNA 質(zhì)量的好壞，直接影響到后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及 PCR 等過(guò)程,。很多時(shí)候,，小伙伴們明明跟著 Trizol 步驟一步一步來(lái)的，謹(jǐn)小慎微,，不敢懈怠,，但就是 RNA 抽提不過(guò)關(guān)。其實(shí) Trizol 抽提 RNA 是個(gè)細(xì)活兒,，小伙伴們根據(jù)自身的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn),，做一下優(yōu)化很有必要~ 

Trizol 標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟（打勾勾的自然是要注意的地方）： 

1、將裂解后樣品或勻漿液室溫放置 5-10 min,，使得核蛋白與核酸*分離,。 

?樣品中如含有較多的蛋白質(zhì)、多糖,、脂肪或其他細(xì)胞外基質(zhì),，可以 12,000  rpm 離心 10 min，移去漂浮的油脂,，取上清,。 

2,、加入 0.2 ml 氯仿，劇烈振蕩 15 sec,，室溫放置 3 min,。12,000 rpm 4°C 離心 10 min。 

?如不能旋渦混勻,，可手動(dòng)顛倒混勻 2 min,。 

?樣品會(huì)分成三層：上層水相，中間層和下層有機(jī)相,。RNA 在上層水相中,。 

3、吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中,，加入等體積異丙醇,，混勻，室溫放置 20 min,。 

?不要吸取任何中間層物質(zhì),，否則會(huì)出現(xiàn)染色體 DNA 污染。 

4,、12,000rpm 4°C 離心 10 min,，棄上清。

?離心前 RNA 沉淀通常是不可見的,，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀,。 

5、加入 1 ml 75%乙醇洗滌沉淀,。12,000 rpm 4°C 離心 3 min,，棄上清。室溫干燥 5-10 min,。 

?75%乙醇用 DEPC 處理過(guò)的水配制,。 

?通常 1 ml Total RNA Extractor 需用 1 ml 75%乙醇洗滌沉淀。 

?不要倒出沉淀,，剩余少量液體短暫離心,，然后用槍頭吸出，不要吸沉淀,。 

?不要晾的過(guò)干,，RNA *干燥后很難溶解，大約晾干 5 min 左右,。 

6,、加入 30-50 µl RNase-free ddH2O，充分溶解 RNA。將所得到的 RNA 溶液置于 -70°C 保存或用于后續(xù)試驗(yàn),。 

?對(duì)于肝,、胰腺、腎等組織中 RNase 含量很高,，沉淀用 100%去離子甲酰胺溶解,。

額外的小 TIP~（第三步）： 

很多剛開始學(xué)抽提的小伙伴吸取上層水相總是吸到中間層物質(zhì)。既然吸上層手容易抖,，那不妨吸下層遺棄然后把剩余的再進(jìn)行離心,。這樣多一步，離完心剩下的基本就是上層水相和中間層沉淀,，再吸取想要的目標(biāo)就能輕松改掉手抖啦～ 

Protocal 改善的地方~(還是第三步)：

3、吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中,，加入 2.5 倍體積乙醇,，1/10 倍體積 3M 醋酸鈉，以及糖原,?；靹颍?80°C 放置 30-60min,。

?不要吸取任何中間層物質(zhì),，否則會(huì)出現(xiàn)染色體 DNA 污染。 

?加入糖原,，使溶液中糖原的最終濃度達(dá)到 50ng/µl,。 

?混勻后，-80°C 放置 30 -60min,，適當(dāng)增長(zhǎng)孵育時(shí)間或者降低孵育溫度將有助于小 RNA 的沉降,。 

?以取 500µl 上層水相為例，則需加入 1250µl 乙醇,，50µl 醋酸鈉以及 4.5µl 糖原原液（原液濃度為：20mg/ml）,。