免除 RNase 的困擾 

RNA 分子異常脆弱,，很容易就會被無處不在的 RNase 降解，輕輕松松的就讓實驗人員的種種努力付之東流,。尤其是當樣品極其稀少且珍貴時,，RNA 的降解更是讓各位小伙伴們想自掛東南枝。因而 RNase 可謂是 RNA 提取的大敵,，那么為了保護好 RNA 分子,，就必須 把 RNase 給 KO 掉。

當然針對外來的敵人,，只要注意這三個小細節(jié),，那么絕對可以克敵制勝。 

（1）嚴格戴好口罩,、手套,。手指和呼吸是外源性 RNase 的主要來源，所以在提取 RNA 時,，一 定全副武裝起來,，才好擒獲 RNA 分子。 

（2）實驗中所涉及的離心管,、槍頭,、移液器、實驗臺面一定要經(jīng)過*處理,。比如,，離心管和槍頭要用 0.1%DEPC 浸泡后并高壓滅菌處理，移液器,、實驗臺面要用 75%的酒精擦拭過,， 玻璃器皿應在使用前用 180℃的高溫下干烤 6h 或更長時間。 

（3）實驗所涉及的試劑/溶液,，尤其是水,，必須確保 RNase-Free。另外,，還需要注意 RNA 的保存時間,，一般 RNA 37℃穩(wěn)定存放 1 天，25℃穩(wěn)定存放一周，4℃可存放一個月或-20℃長期存放,。

可是有時即便小伙伴已經(jīng)如此小心翼翼了,，RNA 分子仍會消失的無影無蹤，細究其原因,，才發(fā)現(xiàn)竟是內(nèi)源性 RNase 在搞鬼,，這不禁讓人感嘆道，不是我們太粗心,，實在是敵人太狡猾,。為了打擊內(nèi)源性 RNase 的囂張氣焰，我們只能千方百計的滅活內(nèi)源酶,，因而便誕生了以下三個妙招,。

1、選擇合適的勻漿方法,。新鮮樣品取材后應立即置于液氮中速凍,，然后可移至-70℃冰箱中保存。在碾磨前,，碾磨用具也必須預冷,。在碾磨過程中，一邊碾磨,，一邊補充液氮,。樣品碾碎后，在液氮剛剛揮發(fā)完時,，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中,，立即混勻勻漿。 

2,、選擇合適的裂解液?，F(xiàn)有市場上常用的裂解液幾乎都能抑制 RNase 活性。但是高內(nèi)源酶含量的樣品,，如肝臟,、脾臟等組織，建議使用含苯酚的裂解液,。苯酚的滅活內(nèi)源酶的能力還是很強的,。 

3、控制好樣品的起始量,。如果樣品的個頭太大,，細胞中就會有些“漏網(wǎng)之魚"免于和裂解液接觸，致使 RNA 很快就會被內(nèi)源酶降解,。因而,，起始量不要太大，如果組織塊過大，可以將切碎后再抽提 RNA,。

明確抽提 RNA 的目的 

一般,，抽提 RNA 的目的無外乎有兩個。首先,，最直接的目的就是要讓 RNA *地完整的釋放出來,。此時對樣品的處理就至關(guān)重要，如果樣品是細胞,，則無須破碎即可直接勻漿；如果是組織甚至器官,，那就需要破碎后才能勻漿,；如果是酵母菌和細菌，則需要先用相應的酶破壁后才能勻漿,。 

其次,，RNA 在不同的實驗中其質(zhì)量的要求是不一樣的，那么后續(xù)實驗就是我們必須要考慮的,。通常 cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應抑制物殘留,；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低,；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高,，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。因而,，不用每次實驗都以獲得最高純度的 RNA 為目的,，從而造成不必要的浪費。

RNA 提取之疑難雜癥 

1,、RNA 產(chǎn)量低

2,、OD260/OD280<1.6

3,、基因組 DNA 污染

4,、RNA 降解

5,、下游的 RT-PCR 實驗不成功

RNA 電泳圖譜剖析 

提取RNA后，為了更好的進行后續(xù)的實驗反應需要通過瓊脂糖電泳來判斷RNA質(zhì)量的好壞,。在此,，將剖析電泳圖上的秘密，幫助大家提高 RNA 抽提的成功率,。

1,、RNA 條帶不亮或缺失

原因分析：（1）上樣量不足,。（2）RNA 跑出凝膠。電泳至溴酚藍至凝膠的 2/3 即可停止電泳,。（3）RNA 在凝膠中發(fā)生擴散,。避免長時間的電泳，否則小片段容易擴散,。（4）RNA 降解,。最大限度減少在紫外線下暴露的時間，使用新鮮的電泳緩沖液,、新制的凝膠,，電泳槽及制膠的模具梳子等用雙氧水浸泡，高電壓短時間電泳（20min）,。也可能使用的組織材料不夠新鮮（冷凍的材料必須在化凍之前將其磨碎）,。

2、RNA 條帶彌散

原因分析：（1）RNA 被核酸酶降解。要用新的緩沖液,，制膠用的模具要清潔,，槍頭要滅菌。（ 2）電壓過高造成電流過大所造成的,。一般為 5—8V/cm,。為了增加條帶的清晰度，電泳開始的幾分鐘建議使用低電壓,。（3）上樣量過大,。根據(jù)沉淀量的多少確定點樣的量，一般 1—3ul,。

3,、點樣孔發(fā)亮

原因解析：（1）上樣量過大,。（2）膠孔未凝固好,，使樣品無法往前移動。（3）RNA 樣品中含有污染物,，如殘留的蛋白質(zhì)容易引起此現(xiàn)象,。可能 trizol 量太少,，應加大 trizol 用量,。另外若殘留 DNA 也應考慮加大 trizol 用量。

4. 出現(xiàn)多條帶

原因解析：（1）RNA 降解。提取過程中出現(xiàn)降解或電泳過程中出現(xiàn)降解（可能性較?。?。（2） 上樣量過大。RNA 由多種類型組成,，若上樣量過大則會導致各種類型的 RNA（tRNA，mRNA 等）均會出現(xiàn)條帶,。