前不久,，為了應(yīng)對細(xì)胞外囊泡（EV）領(lǐng)域快速發(fā)展的挑戰(zhàn)和機(jī)遇,，逐步完善和統(tǒng)一EV的定義、制備,、表征以及功能研究分析等的行業(yè)觀點(diǎn)和準(zhǔn)則,，國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）發(fā)布了最新的《MISEV》（細(xì)胞外囊泡研究的最少信息指南）。MISEV2023匯編了來自ISEV專家組和全球1051名研究人員的反饋,，為研究學(xué)者提供了最新的研究方法和指導(dǎo)原則,，推動(dòng)EVs和外泌體領(lǐng)域更快更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)匕l(fā)展。
作為正交方法驗(yàn)證光學(xué)表征技術(shù)
正交實(shí)驗(yàn)方法是研究多因素多水平試驗(yàn)的一種常用設(shè)計(jì)方法,，也就是當(dāng)確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)的參數(shù)時(shí),，推薦采用兩種或兩種以上不同原理的方法檢測同一指標(biāo)。由于許多EV表征方法不是特定適用于EV的,，或者無法檢測所有的EV,，而檢測同一表征參數(shù)的正交方法（不止一種原理的方法）不太可能具有相同的偏差，因此使用多種不同原理的表征方法對EV 樣本進(jìn)行分析,，互為正交,，互相驗(yàn)證，可以更加確保發(fā)表的EV數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性,。
MISEV2023第一次將RPS技術(shù)作為與基于流式的方法（包括基于微珠的流式和單EV流式）和基于顯微鏡的方法（包括原子力顯微鏡,、電鏡、DLS,、NTA,、超分辨顯微鏡等）并列推薦的常用EV顆粒表征方法。RPS方法作為電學(xué)原理的技術(shù),，也是常用EV粒徑和濃度表征中僅有一個(gè)“非光學(xué)"原理的檢測手段,，可以很好地同其他光學(xué)原理方法（如電鏡、NTA,、原子力顯微鏡,、納米流式等）形成正交，彼此驗(yàn)證,，從而保障和體現(xiàn)數(shù)據(jù)地嚴(yán)謹(jǐn)性,。NanoCoulter作為RPS設(shè)備中的優(yōu)秀者，已在多家外泌體企事業(yè)單位,、藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)和國家計(jì)量單位中進(jìn)行過全面驗(yàn)證,，并得到大家的可信賴數(shù)據(jù)（粒徑、濃度檢測精確度CV%< 5%,，準(zhǔn)確度回收率< ±3%,，n≧ 10）。
較寬的粒徑LOD范圍,，適用于各種EVs
并且,，每一份樣本檢測報(bào)告均出具LOD范圍內(nèi)的粒徑分布直方圖，同時(shí)也展示樣本的平均粒徑,、集中粒徑,、中位粒徑以及寬度系數(shù) (Span) 等綜合統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。
極寬的濃度LOD區(qū)間,，三個(gè)數(shù)量級的線性相關(guān)
MISEV2023建議在發(fā)表或公布某個(gè)樣本的濃度數(shù)據(jù)時(shí),，同時(shí)附上濃度定量所采用的檢測方法，以及該方法在包含所示樣本濃度的某個(gè)濃度區(qū)間中,，連續(xù)稀釋樣本的濃度線性關(guān)系數(shù)據(jù),。這一方面，NanoCouler憑借先進(jìn)的絕對定量原理,，以及精確的濃度檢測穩(wěn)定性,，一經(jīng)推出市場便獲得廣大用戶的青睞。NanoCouler的濃度LOD（檢測限）為5x107- 2x1011 particles/mL,，同時(shí)即使是濃度的LOQ（定量限,，R2> 0.999）都可以在跨三個(gè)數(shù)量級（108- 1010 particles/mL，如下圖）范圍中保持良好的線性相關(guān),。
建議必要的樣本檢測前處理程序
粒徑檢測的高靈敏度（單顆粒粒徑）和高分辨率（< 1 nm） 是RPS技術(shù)的明顯優(yōu)勢,。而與此同時(shí)由于納米孔芯片的設(shè)置，存在較大顆粒的復(fù)雜樣本（如未經(jīng)純化的細(xì)胞培養(yǎng)上清）也就很容易發(fā)生堵塞,，因此MISEV建議使用離心或過濾等分析前步驟來去除較大顆粒,，同時(shí)延長納米孔壽命。同時(shí)應(yīng)明確說明任何分析前處理程序,，以便這些方法更合理地同正交方法進(jìn)行比較,。根據(jù)參考文獻(xiàn)，推薦用戶采用以下超離或超濾步驟：
【超速離心法 (UC)】
方法一：取100-150 mL新鮮或解凍的細(xì)胞懸液或尿液,，使用超速離心機(jī)固定角度轉(zhuǎn)子（k-factor 131,，最大加速和最大減速），或4 mL血漿樣本（k-factor 131,，最大加速和最大減速）在4°C下以120,000 g離心2 h,。在第一次離心后，用PBS重懸EV顆粒,，隨后在4°C繼續(xù)以120,000 g在同一管中進(jìn)行第二次離心2 h,。除去上清液后，將EV樣本收集重懸于100 µL PBS中 [2],。（也建議預(yù)先將細(xì)胞培養(yǎng)基樣本以2000 g離心兩次,，每次10 min，用以去除細(xì)胞或較大的細(xì)胞碎片,，之后用0.45 µm的濾膜過濾后再進(jìn)行超離提純,，效果更佳）
方法二：分離細(xì)胞系EV時(shí),，當(dāng)貼壁細(xì)胞融合度達(dá)70%以上時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)基,。2000 g離心10 min,，去除細(xì)胞和較大碎片。將樣本10,000 g離心1 h,，之后經(jīng)0.45 µm的濾膜過濾,，再100,000 g離心1.5 h后,，將EV樣本收集重懸于100 µL PBS中 [3],。
【體積排阻色譜 (SEC) 與超濾】
空白緩沖液對照為設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)操作流程
MISEV2023在NTA和RPS技術(shù)要求中均提出建議“將空白緩沖液的對照納入檢測流程,，來識別檢測背景"。而NanoCoulter恰恰在設(shè)計(jì)之初就在每個(gè)單次樣本的檢測前,，在程序的標(biāo)準(zhǔn)操作流程中設(shè)置了空白緩沖液（或稀釋液）的對照（如下圖紅框）,，即每一次檢測待測樣本前，程序上必須先以空白緩沖液上樣檢測,，并確認(rèn)檢測電信號基線以及排除潛在的殘余雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn),。并且，瑞芯智造團(tuán)隊(duì)在設(shè)備標(biāo)配緩沖液中加入微量表面活性劑（不影響囊泡）,，從而幫助顆粒樣本的分散,。空白對照的設(shè)置,，幫助用戶嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn),，確定空白背景是否存在干擾的同時(shí)，亦增加了芯片耗材的利用頻次,，極大程度地可重復(fù)使用,，降低檢測成本。
經(jīng)Triton X-100處理，EV顆粒數(shù)目明顯下降,，該樣品純度= (1-破膜后/破膜前) *100% = 87.2%,。
不斷創(chuàng)新優(yōu)化的設(shè)備功能
NanoCoulter系列納米庫爾特單顆粒分析設(shè)備問世之后，也在不斷汲取客戶建議反饋的同時(shí),，進(jìn)行著持續(xù)地軟硬件革新與完善,。目前軟件已升級至v3.2版本（產(chǎn)品說明詳細(xì)展示了設(shè)備及軟件細(xì)節(jié)），且將會(huì)繼續(xù)保持以季度為單位的軟件更新頻率,，并承諾向廣大用戶提供免費(fèi)升級與技術(shù)支持服務(wù),，助力細(xì)胞外囊泡等納米顆粒領(lǐng)域的研究不斷發(fā)展。
1,、Welsh JA, Goberdhan DCI, O'Driscoll L, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024;13(2)
2,、Dong L, Zieren RC, Horie K, et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. J Extracell Vesicles. 2020;10(2)
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