PriCells: 正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

實驗材料：

1. 嬰兒臍帶,；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素,，pH7.2,；

3. 培養(yǎng)用液：M199培養(yǎng)液（含20%小牛血清）；0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA（1:1,，V：V）混合消化液,；D-Hanks液、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素,；

4. 培養(yǎng)器具：玻璃插管與輸液膠管,，培養(yǎng)瓶或皿、白內(nèi)障,、眼科剪,、鑷子等；

培養(yǎng)方法：

1． 在無菌條件下,，取健康產(chǎn)婦分娩后新鮮的嬰兒臍帶（長20cm以上,，不宜超過6h）,，選擇無夾痕、無扭曲,、無凝血阻塞的部分,；

2． 在臍靜脈兩端開口處，分別用絲線扎緊并固定在50ml注射器和帶輸液膠管的玻璃插管上,，注入D-Hanks液沖洗臍靜脈,，至無血跡；

3． 用止血鉗夾住玻璃插管上的輸液膠管,，從另一端的注射器向臍靜脈徐徐注入0.1%膠原酶溶液,，至血管充盈。注意兩端封閉,，以防液體返流,。立即放入37℃的無菌D-Hanks液內(nèi)，15min后取出,；

4． 通過注射器吸取收集酶液,，同時注入含20%小牛血清的M199培養(yǎng)液沖洗靜脈，合并于同一離心管內(nèi),，以1000r/min離心7—10min,；

5． 棄去離心沉淀后的上清液。加入20%小牛血清的M199培養(yǎng)液（pH7.2）,，重新懸浮細(xì)胞,。并調(diào)整至細(xì)胞密度為1.5×105—2.0×105個/ml，接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中,。置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),；

6． 第二天棄培養(yǎng)液，用D-Hanks液輕輕洗1次,，以去除不貼壁的細(xì)胞或死細(xì)胞,。換入新鮮含20%小牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的M199培養(yǎng)液（pH7.2）,。繼續(xù)置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),；

7． 每2—3d換培養(yǎng)液1次。換液時將原培養(yǎng)液棄掉1/2—2/3,，然后加入新鮮的上述培養(yǎng)液至原來的量,。待細(xì)胞長至融合狀態(tài)后，即可行傳代培養(yǎng),；

8． PriCells-原代內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基,；

9． PriCells-原代內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；

10.PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒；

11.PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒,；