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PriCells: 正常大鼠肺泡上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
PriCells: 正常大鼠肺泡上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 正常大鼠的肺組織；
2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,，添加200000IU/L青霉素,、200mg/L鏈霉素，pH7.2,；
3. 肺泡灌洗液Ⅰ：140 mmol/L NaCl,、5 mmol/L KCl、2.5 mmol/L磷酸緩沖液,、10 mmol/L HEPES,、6 mmol/L葡萄糖和0.2 mmol/L EDTA。用無(wú)菌雙蒸水配制,，pH7.4,，肺泡灌洗液使用時(shí)須預(yù)溫到37℃；
4. 肺泡灌洗液Ⅱ：在灌洗液Ⅰ中加入2.0 mmol/L CaCl2和1.3 mmol/L MgSO4,，混勻備用,。肺泡灌洗液使用時(shí)須預(yù)溫到37℃；
5. 酶消化液：0.25%胰蛋白酶溶液和0.1%膠原酶溶液的混合液,；
6. 細(xì)胞分散液：100μg/ml的DNAasc和4%的胎牛血清,；
7. 培養(yǎng)基：多選擇DMEM，配制時(shí)添加10%胎牛血清,、2 mmol/L谷氨酰胺,、10 mmol/L HEPES、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素,；
8. 大鼠IgG：用于包被培養(yǎng)器皿,。臨用前以50 mmol/L的Tris緩沖液（pH9.3）稀釋配制,。用大鼠IgG包被培養(yǎng)皿的方法如下：
①用50 mmol/L的Tris緩沖液稀釋配制鼠IgG（0.5—1mg/mL），均勻地滴加在直徑為10cm的培養(yǎng)皿中,；
②在37℃溫箱中處理4—6h,。用灌洗液Ⅱ洗3次。最好用無(wú)血清DMEM洗1次,，備用,；
9. 培養(yǎng)器具：不銹鋼網(wǎng)篩（80目、200目和280目）,、培養(yǎng)皿或瓶,、手術(shù)刀、解剖剪,、解剖鑷,、眼科剪，眼科鑷,，止血鉗,，無(wú)菌消毒手術(shù)器械；
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 取雄性Wistar或SD大鼠,，體重180—200g,。腹腔麻醉，注射3%戊巴bi妥鈉10mg/kg和肝素400U/kg,。無(wú)菌條件下剖胸,，切開(kāi)氣管插管，動(dòng)物放血致死,；
2. 經(jīng)氣管插管肺內(nèi)通氣數(shù)次,，至肺呈蒼白色（注意通氣壓不可過(guò)大，以免將組織吹破）,；
3. 整體取出心,、肺和氣管，并用肺泡灌洗液Ⅰ經(jīng)插管肺內(nèi)灌洗4—6次（每次5ml）,。再用肺泡灌洗液Ⅱ灌洗2次,；
4. 肺內(nèi)灌注（消化液）0.25%胰蛋白酶溶液和0.1%膠原酶溶液的混合液。37℃水浴消化15—30min,。每隔3—5min后添加消化液,；
5. 去除心臟、氣管及肺門(mén)周?chē)慕Y(jié)締組織,，在5min內(nèi)快速將肺組織剪成1—2mm3大小的組織塊；
6. 加入總量為4ml的細(xì)胞分散液,，以終止消化,，并將聚集成團(tuán)的細(xì)胞分散,；
7. 將切碎的肺組織塊倒入三角燒瓶?jī)?nèi)，用灌洗液Ⅱ補(bǔ)足至20ml,37℃水浴條件下晃動(dòng)5min（130次/min）,；
8. 懸液經(jīng)80目,、200目和280目不銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾；
9. 收集濾液,，放入10ml尖底離心管中,，以400r/min離心8—10min；
10. 棄上清液,，用DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,；
11. 將8—10ml細(xì)胞懸液加到用大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿上，在37℃,、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育3h,；
12. 收集細(xì)胞懸液，以400r/min離心8—10min后,，棄上清液,，再用無(wú)血清DMEM漂洗1次。
13. 用20%胎牛血清DMEM懸浮細(xì)胞,，并進(jìn)行細(xì)胞活力鑒定,；
14. 將上述懸液的細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度,。按1×106—3×106個(gè)/cm3的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中,。放37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。培養(yǎng)24小時(shí)后換液,，去除未貼壁細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，以后每周換液2—3次,；
PriCells提供：
1. 各種原代細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基,；
2. 各種原代細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；
3. 原代細(xì)胞分離試劑盒,；
4. 原代細(xì)胞鑒定試劑盒,；
5. 各種原代細(xì)胞DNA；
6. 各種原代細(xì)胞RNA,；
7. 各種原代細(xì)胞蛋白質(zhì),；