細(xì)胞名稱： HL-60(人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞)
細(xì)胞別稱： HL 60; HL60
細(xì)胞貨號： SNL-040
生長特性： 懸浮
培養(yǎng)條件： 1640+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境： 空氣,，95%； 二氧化碳 (CO2),，5%,；37℃
細(xì)胞簡介： HL-60細(xì)胞是源自一位患有急性粒-單核細(xì)胞白血病的36歲白人女性的早幼粒細(xì)胞系。HL-60細(xì)胞自發(fā)分化,，丁酸鹽,、次黃嘌呤、佛波醇,、肉豆蔻酸,、DMSO(1%-1.5%)、放線菌素D和視黃酸均可以促進(jìn)分化,。HL-60細(xì)胞表現(xiàn)出吞噬活性,，并對趨化刺激有響應(yīng)；HL-60細(xì)胞致癌基因myc表達(dá)陽性,。該細(xì)胞系可用于免疫紊亂和免疫學(xué)研究,。
細(xì)胞正常生長形態(tài)照片
HL-60細(xì)胞培養(yǎng)注意事項
l HL-60細(xì)胞懸浮圓形生長，偶有小聚團(tuán),，屬于正?，F(xiàn)象，無需吹散,；
l 少量細(xì)胞附著瓶底屬于正?，F(xiàn)象，可將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新瓶,，丟棄貼壁的細(xì)胞；
l 圓形透亮,、細(xì)胞膜完整的細(xì)胞是活細(xì)胞,，如果無法判斷，可以取少量細(xì)胞用臺盼藍(lán)染色后計數(shù)確定細(xì)胞活率,；
l 接種密度建議在10萬-50萬細(xì)胞/mL之間為宜,，密度過低或過高都可能造成細(xì)胞狀態(tài)變差；
l 復(fù)蘇時需盡快離心去除DMSO,，避免DMSO刺激HL-60細(xì)胞發(fā)生分化,；
l HL-60細(xì)胞生長需要穩(wěn)定的環(huán)境，不頻繁拿出培養(yǎng)箱,，不頻繁離心,；
l 當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)較差時,，不建議對細(xì)胞進(jìn)行離心，需換液時可采用半換液法（詳細(xì)步驟見下文）
HL-60細(xì)胞換液方法
l 半換液法：
1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基,、離心管以及無菌槍頭等,；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）
2. 將培養(yǎng)瓶豎立靜置一段時間，待細(xì)胞沉底,；（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況）
3. 小心吸出一半的培養(yǎng)基,，轉(zhuǎn)移到離心管；
4. 900-1000rpm 3min離心,，離心管里若有細(xì)胞,，則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶；
5. 原瓶補(bǔ)充一半的新鮮培養(yǎng)基,，混勻細(xì)胞,，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
l 離心換液法：
1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基,、離心管以及無菌槍頭等,；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）
2. 將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；
3. 900-1000rpm,，3min離心,；
4. 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL,，T75推薦20mL）
5. 離心完成后棄上清,，加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中,，混勻細(xì)胞,，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
HL-60細(xì)胞傳代方法
l 離心法：
1.取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)確定細(xì)胞密度,，密度80萬/mL以上傳代,，并根據(jù)計數(shù)結(jié)果確定傳代比例；
2.準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基,、離心管以及無菌槍頭等,；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）
3.用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；
4.900-1000rpm,，3min離心收集細(xì)胞,；
5.在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL,，T75推薦20mL）
6.離心完成后,，棄離心管內(nèi)上清，然后加入適量新鮮培養(yǎng)基，輕輕重懸吹散細(xì)胞,，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
Tips：懸浮細(xì)胞通常都偏脆弱,，注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉(zhuǎn)速以及時間不要過高,，避免細(xì)胞受機(jī)械損傷。
l 直接分瓶法：
1. 取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)確定細(xì)胞密度,，密度80萬/mL以上傳代,，并根據(jù)計數(shù)結(jié)果確定傳代比例；
2. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶,，使細(xì)胞均勻分散,；
3. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液，均分到若干個新培養(yǎng)瓶中,，每瓶再補(bǔ)充適量的新鮮培養(yǎng)基,，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
Tips：用直接分瓶法傳代1-2次后需進(jìn)行離心傳代,。
HL-60細(xì)胞凍存方法
1. 取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)確認(rèn)細(xì)胞密度,。
Tips：若凍存前培養(yǎng)基已經(jīng)變黃，先換液靜置培養(yǎng)4h左右,，待細(xì)胞活力穩(wěn)定后再進(jìn)行凍存,。
2. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、PBS,、血清,、DMSO、離心管以及無菌槍頭等,；（試劑需提前預(yù)熱）
3. 根據(jù)收集到細(xì)胞量,，配制相應(yīng)量的凍存液，并準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的凍存管,，在凍存管上標(biāo)志細(xì)胞名稱,，代次，凍存時間等信息,。推薦凍存液配方：92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO,；凍存密度200-300萬細(xì)胞/mL/管。
Tips：凍存密度過低將導(dǎo)致復(fù)蘇后狀態(tài)不佳,。
4. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中1000rpm，3min離心收集細(xì)胞,；
5. 離心完成后棄上清,，加入相應(yīng)量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細(xì)胞，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度,，不要產(chǎn)生過多氣泡,；
Tips：加入凍存液混勻細(xì)胞后及時分裝并將細(xì)胞降溫凍存，以減少DMSO對細(xì)胞的毒性,。
6. 將細(xì)胞放置程序降溫凍存盒中,，再將凍存盒轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進(jìn)行降溫凍存。
7. 次日復(fù)蘇一管檢查凍存效果,，確認(rèn)沒問題后及時將凍存細(xì)胞放置液氮中保存,，細(xì)胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。
HL-60細(xì)胞復(fù)蘇方法
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；
2. 將凍存細(xì)胞從液氮或-80℃冰箱中取出,，迅速置于37℃水浴,，快速搖晃至完*融化，融化時間1min左右,；
3. 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心,，同時在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；
4. 離心完成后棄上清,，吸取1mL新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞,，吹散細(xì)胞后接種到培養(yǎng)瓶中；
5. 使用十字法或8字法將細(xì)胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
Tips：
1. 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運送至細(xì)胞房。
2. 細(xì)胞融化后需盡快離心去除DMSO,，避免DMSO刺激HL-60細(xì)胞發(fā)生分化,。
3. 整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
HL-60細(xì)胞收貨攻略
1. 拆封包裝盒,，確認(rèn)細(xì)胞,，說明書等是否齊全，收貨細(xì)胞名與所購買細(xì)胞是否符合,；
2. 觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好,，有無漏液，培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等,，發(fā)現(xiàn)異常及時拍照聯(lián)系銷售人員,；
3. 確認(rèn)無異常后，將培養(yǎng)瓶表面消毒,，然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右,，讓懸浮細(xì)胞沉下培養(yǎng)瓶底部；
4. 平衡過程中可以仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，知悉細(xì)胞所需培養(yǎng)體系,，培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項等,；
5. 平衡完成后豎立取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，此時大部分細(xì)胞沉在培養(yǎng)瓶底部,，小心吸取上清至離心管中,，保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi)，小心操作,，盡量不要吸到沉在底部的細(xì)胞,；
6. 將離心管1200rpm，5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞,，上清可以4℃保存,，后續(xù)用于培養(yǎng)細(xì)胞，以平穩(wěn)過度到自己的培養(yǎng)基,。將收集到的細(xì)胞接種至原培養(yǎng)瓶,；
7. 輕輕混勻細(xì)胞，取100-200ul細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù),，根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)密度,。然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
常見問題及解決方案
1.細(xì)胞密度怎么計算的,？
嚴(yán)格意義上,，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中,，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而計數(shù),。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值,，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式,。
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理,？
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個屬于細(xì)胞自身特性,，無法清除也無法改變,，大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng),、營養(yǎng)缺乏,、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件,。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可通過900-1000rpm,，3min離心以去除部分碎片,。少量碎片不影響細(xì)胞生長，不建議頻繁離心,。
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