--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱： NK-92MI(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細(xì)胞)

細(xì)胞別稱： NK-92MI MI; NK-92MI mi; NK92-MI; NK92MI; NK-92MI transfected with MFG-Hil2

細(xì)胞貨號： SNL-195

生長特性： 懸浮

培養(yǎng)條件： 1640+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境： 空氣,，95%,； 二氧化碳 (CO2)，5%,；37℃

細(xì)胞簡介： NK-92細(xì)胞是從一位患有急進(jìn)性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細(xì)胞衍生來的一株IL-2依賴型NK細(xì)胞株,。NK-92MI細(xì)胞是轉(zhuǎn)染得到的源自NK-92細(xì)胞的IL-2非依賴的NK細(xì)胞株，親本細(xì)胞NK-92通過微粒體基因轉(zhuǎn)化法用逆轉(zhuǎn)錄病毒MFG-hIL-2載體攜帶的人IL-2cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化,，可能由于載體整合到基因組DNA中,，轉(zhuǎn)化是穩(wěn)定的。NK-92MI細(xì)胞細(xì)胞對很多惡性細(xì)胞有細(xì)胞毒性,；鉻釋放試驗顯示它能殺死K562細(xì)胞和Daudi細(xì)胞,。NK-92細(xì)胞有以下特征：CD2、CD7,、CD11a,、CD28、CD45,、CD54表面標(biāo)記陽性,；CD1、CD3,、CD4,、CD5、CD8,、CD10,、CD14、CD16,、CD19,、CD20、CD23,、CD34和HLA-DR表面標(biāo)記陰性,。NK-92MI細(xì)胞和NK-92CI細(xì)胞這兩個變種都包含、表達(dá)并合成hIL-2cDNA,。NK-92MI細(xì)胞合成的IL-2水平比NK-92CI高,，而親本細(xì)胞不合成表達(dá)。1998年9月提交到ATCC的培養(yǎng)物污染了支原體,，其后代通過BM細(xì)胞周期蛋白處理21天消除支原體,，處理后6周，用Hoechst染色、PCR和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)測試進(jìn)行支原體檢測,，結(jié)果都呈陰性,。

細(xì)胞正常生長形態(tài)照片

NK-92MI細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

l NK-92MI細(xì)胞呈聚團懸浮生長，細(xì)胞團較大時需要吹打成小團,，防止團塊中間的細(xì)胞因營養(yǎng)不足而死亡,。除非實驗需要，不建議經(jīng)常將細(xì)胞吹散成單個細(xì)胞,，否則細(xì)胞狀態(tài)將變差,；

l NK-92MI細(xì)胞對血清要求高，應(yīng)該使用優(yōu)質(zhì)血清進(jìn)行培養(yǎng),；

l NK-92MI細(xì)胞對吹打等機械刺激敏感，不要吹打太多次,，注意控制吹打力度輕柔,；

l NK-92MI細(xì)胞對溫度敏感，培養(yǎng)基,、PBS需復(fù)溫至37℃再使用,。

l NK-92MI細(xì)胞凍存難度較大，建議使用90% FBS+10%DMSO凍存液,，凍存密度推薦300萬細(xì)胞/毫升,，不能過低。凍存時細(xì)胞應(yīng)吹散成單細(xì)胞,。

l 復(fù)蘇時建議將血清濃度提高至20%,，待細(xì)胞可以正常聚集生長后再將血清濃度恢復(fù)至10%

l NK-92MI細(xì)胞計數(shù)時算得的細(xì)胞的活率不能代表該細(xì)胞真實的狀態(tài)。因為培養(yǎng)時存在一些散在的單細(xì)胞,，這些細(xì)胞活性較低,，且不能完*去除，導(dǎo)致在計數(shù)時細(xì)胞整體活率可能不高,。細(xì)胞狀態(tài)可以通過細(xì)胞能否聚團判斷：只要大部分細(xì)胞能聚團生長,，細(xì)胞狀態(tài)就沒有問題。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不佳時,，細(xì)胞無法順利聚團,。

l 當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不佳時，向培養(yǎng)基中按100-200U/mL補充IL-2,，可有效改善,。

NK-92MI細(xì)胞換液方法

l 半換液法：

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等,；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）

2. 將培養(yǎng)瓶豎立靜置一段時間,，待細(xì)胞沉底；（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況）

3. 吸頭緊貼液面，小心吸出一半的培養(yǎng)基,，轉(zhuǎn)移到離心管,；

4. 900-1000rpm 3min離心，離心管里若有細(xì)胞,，則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶,；

5. 原瓶補充一半的新鮮培養(yǎng)基。

Tips：建議半換液2-3次后進(jìn)行離心換液,。

l 離心換液法：

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基,、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）

2. 將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,；

3. 900-1000rpm,，3min離心；

4. 棄上清,，加5mL PBS輕輕重懸細(xì)胞進(jìn)行潤洗,，再900-1000rpm，3min離心,；

Tips：此處PBS潤洗是為了去除細(xì)胞碎片,，平時培養(yǎng)若細(xì)胞碎片不多可以忽略此步驟。

5. 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基,；

6. 離心完成后棄上清,，加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中,，混勻細(xì)胞,，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

NK-92MI細(xì)胞傳代方法

l 離心法：

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基,、離心管以及無菌槍頭等,；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）

2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；

3. 900-1000rpm,，3min離心收集細(xì)胞,；

4. 在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL,，T75推薦20mL）

5. 離心完成后,，棄離心管內(nèi)上清，然后加入適量新鮮培養(yǎng)基,，輕輕重懸吹散細(xì)胞,，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。

l 直接分瓶法：

1. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶,，使細(xì)胞均勻分散,；若有較大的細(xì)胞團，需吹散成小團,。

2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液,，均分到若干個新培養(yǎng)瓶中，每瓶再補充適量的新鮮培養(yǎng)基,，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。

Tips：

l 注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉(zhuǎn)速以及時間不要過高，避免細(xì)胞受機械損傷,。

l 傳代比例推薦1：2

NK-92MI細(xì)胞凍存方法

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基,、PBS、血清,、DMSO,、離心管以及無菌槍頭等；（試劑需提前預(yù)熱）

Tips：若凍存前培養(yǎng)基已經(jīng)變黃,，先換液靜置培養(yǎng)4h左右,，待細(xì)胞活力穩(wěn)定后再進(jìn)行凍存。

2. 根據(jù)收集到細(xì)胞量,，配制相應(yīng)量的凍存液，并準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的凍存管,，在凍存管上標(biāo)志細(xì)胞名稱,，代次，凍存時間等信息,。推薦凍存液配方：90%FBS+10%DMSO,；凍存密度300萬細(xì)胞/mL/管。

Tips：凍存密度過低將導(dǎo)致復(fù)蘇后狀態(tài)不佳,。

3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中1000rpm,，3min離心收集細(xì)胞；

4. 離心完成后棄上清,，加入相應(yīng)量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細(xì)胞,，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度,，不要產(chǎn)生過多氣泡,；

Tips：加入凍存液混勻細(xì)胞后及時分裝并將細(xì)胞降溫凍存，以減少DMSO對細(xì)胞的毒性,。

5. 將細(xì)胞放置程序降溫凍存盒中,，再將凍存盒轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進(jìn)行降溫凍存。

6. 次日（16h-24h后）復(fù)蘇一管檢查凍存效果,，確認(rèn)沒問題后及時將凍存細(xì)胞放置液氮中保存,，細(xì)胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天,。

NK-92MI細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,，離心機設(shè)置好轉(zhuǎn)速,；

2. 將凍存細(xì)胞從液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴,，快速搖晃至完*融化,，融化時間不超過2min；

Tips：

l 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運送至細(xì)胞房,。

l 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染,。

3. 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心,，同時在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；

4. 離心完成后棄上清,，吸取1mL新鮮培養(yǎng)基（建議血清濃度提高至20%）輕輕重懸細(xì)胞,，吹散細(xì)胞后接種到培養(yǎng)瓶中；

5. 使用十字法或8字法將細(xì)胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

Tips：整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成,。

NK-92MI細(xì)胞收貨攻略

1. 拆封包裝盒，確認(rèn)細(xì)胞,，說明書等是否齊全,，收貨細(xì)胞名與所購買細(xì)胞是否符合；

2. 觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好,，有無漏液,，培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等，發(fā)現(xiàn)異常及時拍照聯(lián)系銷售人員,；

3. 確認(rèn)無異常后,，將培養(yǎng)瓶表面消毒，然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右,，讓懸浮細(xì)胞沉下培養(yǎng)瓶底部,；

4. 平衡過程中可以仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，知悉細(xì)胞所需培養(yǎng)體系,，培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項等,；

5. 平衡完成后豎立取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，此時大部分細(xì)胞沉在培養(yǎng)瓶底部,，小心吸取上清至離心管中,，保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi)，小心操作,，盡量不要吸到沉在底部的細(xì)胞,；

6. 將離心管1200rpm,，5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞，上清可以4℃保存,，后續(xù)用于培養(yǎng)細(xì)胞,，以平穩(wěn)過度到自己的培養(yǎng)基。將收集到的細(xì)胞接種至原培養(yǎng)瓶,；

7. 觀察細(xì)胞,，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，以及團塊數(shù)量,、大小決定傳代或繼續(xù)培養(yǎng),。

常見問題及解決方案

培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,，這個屬于細(xì)胞自身特性,，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象,，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏,、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,，可通過900-1000rpm,，3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細(xì)胞生長,，不建議頻繁離心。

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