--細(xì) 胞 基 本 信 息---
細(xì)胞名稱: HK-2(人腎小管上皮細(xì)胞)
細(xì)胞別稱: Hk-2; HK2; Human Kidney-2
細(xì)胞貨號: SNL-165
生長特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM/F12+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 空氣,95%,; 二氧化碳 (CO2),,5%;37℃
細(xì)胞簡介: HK-2細(xì)胞屬源于正常腎的近曲小管細(xì)胞,,通過導(dǎo)入HPV-16 E6/E7基因而獲得永生化,。將含有HPV-16 E6/E7基因的重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN 16 E6/E7轉(zhuǎn)染外生包裝細(xì)胞Psi-2;Psi-2細(xì)胞產(chǎn)生的病毒再去感染兼嗜性包裝細(xì)胞系PA317,,最后將PA317細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒導(dǎo)入正常的腎皮質(zhì)近曲小管細(xì)胞,。盡管pLXSN 16 E6/E7中含有新霉素抗性,,但未用G418篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)克隆。Southern和FISH分析顯示,,HK-2細(xì)胞來源于單克隆,。PCR檢測證實,HK-2細(xì)胞基因組中含有E6/E7基因,。HK-2細(xì)胞保留了指示分化良好的PTCs的表型,,細(xì)胞堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶,、亮氨酸氨基肽酶,、酸性磷酸酶、細(xì)胞角蛋白,、α3,、β1整合素和纖維連接蛋白呈陽性,因子VIII相關(guān)抗原,、6.19抗原和CALLA內(nèi)肽酶呈陰性,。HK-2細(xì)胞還保留了近端腎小管上皮的功能特征,如Na+依賴性/根皮苷敏感性糖轉(zhuǎn)運和腺苷酸環(huán)化酶對甲狀旁腺的反應(yīng)性,,但對抗利尿激素的反應(yīng)性,。HK-2細(xì)胞能夠進(jìn)行糖異生,其制造和儲存糖原的能力證明了這一點,。HK-2細(xì)胞是貼壁依賴性的,,不會在甲基纖維素、軟瓊脂或懸浮液中生長,。HK-2細(xì)胞可以重現(xiàn)用新鮮分離的PTC獲得的實驗結(jié)果,。HK-2細(xì)胞在毒理學(xué)研究中有應(yīng)用。
細(xì)胞正常生長形態(tài)照片
HK-2細(xì)胞培養(yǎng)注意事項
1. 細(xì)胞內(nèi)有空泡
培養(yǎng)時可見部分細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)存在空泡,,這是該細(xì)胞正常的生理活動,,不影響生長,無需擔(dān)心,。
2. 細(xì)胞生長速度偏慢
注意控制傳代密度不要過低,,否則生長速度會極慢。推薦傳代比例1:2-1:4(具體情況視細(xì)胞生長速度及密度決定),。
3. 黑點較多
該細(xì)胞培養(yǎng)時背景中可能有黑點,,為細(xì)胞代謝產(chǎn)物和細(xì)胞碎片,不影響細(xì)胞生長,。若黑點較多可以通過PBS潤洗或換液清除,。如果黑點較多同時出現(xiàn)細(xì)胞變形、大量死亡或不生長的情況,應(yīng)該考慮操作不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞受損或者存在支原體污染,。
HK-2細(xì)胞傳代方法
1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基,、胰酶、PBS,、離心管,、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等;(試劑提前預(yù)熱)
2. 抽走培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基,,加5mL PBS潤洗1-2遍,,清除殘留培養(yǎng)基;
3. 盡量吸干潤洗的PBS后加1mL胰酶,,搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底,放置培養(yǎng)箱37℃消化適當(dāng)時間,,鏡下可見細(xì)胞明顯回縮,,輕拍培養(yǎng)瓶部分細(xì)胞開始脫落時立即加入3-4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化,吹落貼壁的細(xì)胞,;
Tips:注意控制吹打力度輕柔,,吹打次數(shù)不可過多,避免機(jī)械損傷
4. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,,1000rpm,,3min離心收集細(xì)胞;
5. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基,;(T25推薦10mL,,T75推薦20mL)
6. 離心完成后,棄上清,,加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞,,將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,十字法或8字法混勻,,然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),,注意培養(yǎng)瓶蓋透氣;
Tips:推薦傳代比例1:2-1:4,,首*傳代建議1:2,。細(xì)胞生長至80%密度時即可傳代。
HK-2細(xì)胞凍存方法
1. 配制程序性凍存液,,準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標(biāo)記,。
Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO
2. 先將細(xì)胞按傳代步驟消化、離心,、棄上清,,獲得細(xì)胞沉淀;
3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中,;
4. 將凍存管放入程序性凍存盒,,放入-80℃冰箱過夜;
5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置
Tips:
l 液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細(xì)胞的活性,,若活性合格即可長期保存,。
l 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程,。
l T25培養(yǎng)瓶長滿通??蓛龃?-3管,10cm皿長滿通??蓛龃?-4管,。
l 凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。
HK-2細(xì)胞復(fù)蘇方法
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;
2. 將細(xì)胞從液氮罐中取出,,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,,捏住管蓋,將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,,細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴,,融化過程不超過2min;
Tips:
l 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),,細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運送至細(xì)胞房,。
l 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,取出細(xì)胞時震動不要過大,。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,,若有液氮需靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù),,避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷,。
l 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染,。
3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,,不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會有差異
4. 離心完成后棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,,輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中,,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;
5. 復(fù)蘇24小時后觀察細(xì)胞貼壁情況,。
Tips:
1. 整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成,。
2. 該細(xì)胞貼壁需要穩(wěn)定的環(huán)境,復(fù)蘇完成后請勿頻繁將細(xì)胞拿出觀察。
HK-2細(xì)胞收貨攻略
l 常溫細(xì)胞
1. 收貨后,,拆開外包裝,,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上,;
2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL,,顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,觀察細(xì)胞密度,,若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代(首*傳代比例建議1:2),,若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng);
l 凍存細(xì)胞
1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查,,若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長期保存,,若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決;
2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,,以免超出售后期,,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;
3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員,,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作,;
Tips:
1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液,、培養(yǎng)瓶破損,、干冰完*揮發(fā)等異常情況時,及時拍照聯(lián)系銷售人員,;
2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基,,可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng),;
常見問題及解決方案
細(xì)胞密度怎么計算的,?
嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞數(shù)量,,但在實際培養(yǎng)過程中,,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計數(shù)。因此,,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值,,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,,當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀,、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式,。
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個屬于細(xì)胞自身特性,,無法清除也無法改變,,大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng),、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,,建議使用合適的培養(yǎng)條件,。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化,,混勻細(xì)胞,,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清,。再加5mL PBS重懸細(xì)胞,,再離心后,用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿,。第二次PBS重懸是為了去除碎片,,如果平時碎片比較少,傳代時可以省略PBS重懸的步驟,;如果碎片很多,,建議PBS多洗幾次。
NO.3細(xì)胞具體消化時間是多久,?
每個實驗室用的胰酶活力及消化步驟,、試劑都是不一樣的,不能完*規(guī)定消化時間,,以實際消化效果和實驗經(jīng)驗為準(zhǔn),。
產(chǎn)品推薦:
【SNL-165】 HK-2 (人腎小管上皮細(xì)胞)
【SNLM-165】HK-2細(xì)胞專用完*培養(yǎng)基
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