細胞培養(yǎng)千千萬,，隔天一看全完蛋。我待細胞如初戀,，奈何細胞黑了臉,。試問何處方有解，細胞世界看小尚,?？蒲姓朗菧嫔＃礁咚h伴君旁,。
Hello,，各位小伙伴們大家好，我是尚恩生物技術(shù)支持小尚,，歡迎大家來到尚恩生物科普類技術(shù)講解欄目-細胞世界,，本欄目致力于深入淺出的對細胞培養(yǎng)過程種所遇到的一些現(xiàn)象進行講解，歡迎持續(xù)關(guān)注,。好了,，今天就先水到這，話不多說,，咱們直接開始,。
相信很多小伙伴們在進行貼壁細胞培養(yǎng)時經(jīng)常會看到一些比較大的圓形透亮的東西，謹慎且好奇的小伙伴不禁心里泛起嘀咕：
這到底是什么,？以前怎么沒有見過,？會不會是污染了奇奇怪怪的東西？
(什么,？你說你沒有見過,？那有沒有一種可能，你看細胞過于專注于貼壁的細胞了,，根本沒有注意到圓圓的,？)
案 例 分 享
小伙伴A:IEC-6細胞，細胞從一開始就有小圓圈圈,形態(tài)不一致,是不是真菌污染了
小伙伴B：A2780這種亮晶晶的細胞,，是雜細胞嗎 我之前買過類似的細胞,，里面有雜細胞，我怕又買了雜細胞,。
這時候就輪到有8年多細胞培養(yǎng)經(jīng)驗,、6年技術(shù)支持經(jīng)驗的小尚出馬了。
我們先指出來這兩個客戶反應(yīng)的問題在哪,，免得有些過于專注貼壁細胞的小伙伴還沒看出來這兩個小伙伴講的是個啥,。
喏，看到紅色箭頭指的位置了嘛,，就是這個圓圓的,，為了方便，我們在這里就把它叫做球球,。
（這里不得不吐槽下,，有些小伙伴的拍照技術(shù)真的堪憂，你笑別的小伙伴拍的看不清,，殊不知更有小伙伴拍的連細胞都看不到,。一想到這，小尚不禁淚流,，看了六年的照片,，六年！你知道這六年我怎么過的嘛,？你們這拍照技術(shù),，給對象拍照那不得分分鐘被爆錘？）
好了,，回歸正題,。
真菌排除
首先，球球這個東西肯定不是小伙伴A說的真菌,，因為大部分常見的真菌在培養(yǎng)基里都是以營養(yǎng)體的形式存在,，其中大部分又是呈樹枝狀分叉或者規(guī)則形態(tài)的菌絲,，就像下面這樣。
這樣看明顯都不是圓形的,，基本可以排除這部分真菌,。當然還有一部分單細胞真菌是圓形的，比如酵母菌,，它就長這樣,。
那有反應(yīng)快的小伙伴就激動了：對對對，就是它就是它,，球球就是酵母菌,，罪魁禍首！
?小尚跟你說：小伙子反應(yīng)快是好事,，但你還是太年輕,，把握不住,，給你五毛,，撤回讓我來。其實實際上球球也并不是酵母菌,，原因很簡單,，常見酵母菌大小比哺乳動物細胞還是小很多的，就像下圖這樣,，其中培養(yǎng)的細胞大家都看得出來,，而那真菌黑色箭頭指的才是酵母菌，是不是比細胞小多了,？這樣看就對比很明顯了,，大小差異幾乎直接可以排除酵母菌的可能。
那又有較真的小伙伴說了：那真菌也有大的啊,，不可能是一些大的真菌嘛,。
?小尚跟你說：這又涉及到另一方面了，真菌作為比較簡單的生物,，其增殖速度通常是比哺乳動物的細胞快很多的,。如果真菌都到能在顯微鏡下輕易看到的程度，那這個細胞再在培養(yǎng)箱甚至室溫放1-2天,，就會明顯渾濁到肉眼可見的程度,，也基本上宣告細胞涼涼了，根本沒有辦法繼續(xù)培養(yǎng),。
所以,，通過形態(tài)、大小差異和生長速度判斷，球球不是真菌,。
雜細胞排除
接下來,，我們看看是不是小伙伴B說的雜細胞呢？
這種情況通常就不是簡單的看形態(tài)下可以分辨出來的了,，必須要進行實驗進行驗證,。
?第一種實驗很簡單，我們姑且取名培養(yǎng)法,，就是利用貼壁程度差異收集圓形和貼壁細胞分別培養(yǎng)，看最終培養(yǎng)出來的細胞是否一樣,。如果確實長出來的細胞是一樣的,，基本可以確認不是雜細胞；如果長出來確實不一樣,，就得利用到下面的方法了,。
?第二種方法是進行標志物檢測，我們都知道不同類型的細胞標志物不一樣,，比如內(nèi)皮細胞標志物是CD31,、成纖維細胞標志物是Vimentin等，這類標志物可以一定程度上反應(yīng)細胞是否存在雜細胞,。當然實際上來說,，原代細胞提取必然存在部分雜細胞，檢測陽性率肯定不會是100%,。細胞系和細胞株理論上來說是純細胞,，那應(yīng)該陽性率是100%了？這還真不一定,，例如CA46細胞（DSMZ ACC-73）標志物CD19表達率99%,、CD20表達率92%，確實是會有一些細胞不表達標志物,，但這也不能說明細胞不純,。細胞在不同增殖周期、不同培養(yǎng)條件下標志物表達情況都會有差異,，這個是很正常的現(xiàn)象,。就像即使是雙胞胎，總會有這里那里的區(qū)別,，正如世界上沒有相同的兩片樹葉這句話一樣,。所以，標志物檢測也只能作為參考,，并不能斷定,。
?第三種方法就是進行細胞鑒定了，這就是最客觀公正的驗證方式了，這里又可以分兩個情況,。
第一個情況就是不同種屬細胞交叉污染,，另一種是同種屬交叉污染。
⊙1.前者只要做個種屬鑒定就可以了,，種屬特異性引物,、試劑盒、檢測服務(wù)在很多公司都有,，相對來說比較簡單,。
⊙2.第二個情況是必須對細胞進行STR鑒定了，STR鑒定可以有效的分辨同種屬之間的細胞交叉污染（不了解STR過程的小伙伴可以查下相關(guān)資料,，需要講解的話可以私信吱一聲,，如果需要了解的小伙伴多的話，我們可以在后續(xù)專門講解）,。STR是目前可靠的細胞鑒定方法,，但這種方法也有局限性，那就是這個必須有相應(yīng)的特異性引物才能對該種屬進行鑒定,，同時也必須要有公開的位點信息才能做細胞系匹配,。目前人源STR比較成熟，相關(guān)位點和引物都滿足科研甚至是診斷需要,，基本可以判斷細胞是否存在交叉污染甚至是確認污染的是那個細胞系（順帶提一句,，小尚家的人源細胞提供STR報告，可以排除細胞存在交叉污染的情況哦）,；小鼠源的STR近些年也有發(fā)展,，但總體來說目前只有80來種細胞系有位點可以匹配，其他沒有公開的位點,，由于位點缺乏可對比性,，所以相對來說檢測結(jié)果大部分不能用于細胞匹配，用來判斷細胞是否存在交叉污染是沒有問題的,，但基本無法判斷是什么細胞交叉污染,；至于大鼠、猴,、雞,、狗、豬等其他種屬,，那就更慘了,，目前一個公開的位點都沒有，做出來STR只能判斷細胞是否交叉,，根本沒法判斷交叉的種類,。
其實呢，雖然國內(nèi)細胞相關(guān)產(chǎn)業(yè)相比國外起步晚，但近幾十年確實得到了飛速發(fā)展,，細胞保種都相對比較規(guī)范了,，極少出現(xiàn)細胞相互交叉污染的情況。小尚自己也做過很多細胞的鑒定,，基本不存在細胞交叉污染的現(xiàn)象,。有很多細胞其實本身就是有多種形態(tài)存在的，鑒定結(jié)果顯示他們確實都是一樣的細胞,。當然,，各位小伙伴在培養(yǎng)的時候還是得規(guī)范操作，避免細胞間交叉污染,，因為一旦交叉污染就不能用了,，只能重新培養(yǎng)。
答 案 揭 曉
看了這么久,，相信很多小伙伴都撓頭了，如果說球球不是真菌也不是雜細胞,，那到底是什么,？
我們先看一段視頻，注意仔細盯著球球看,，可以多看幾遍盯著不同位置的球球看,。
（來源日本JCRB細胞庫資料）
發(fā)現(xiàn)了嘛，這個球球大部分都會一分為二并在之后化身貼壁細胞消失不見,。
所以答案揭曉,，球球其實也是正常的細胞，由于空間不足或者其他原因?qū)е聸]有貼壁而呈圓形生長,，同時又由于細胞是一直在增殖的,，所以這個球球貼壁了，那個球球又冒出來了,，看起來就像是一直都存在一樣,，其實人家已經(jīng)一批又換一批了。
這個其實是細胞增殖過程中很常見的現(xiàn)象,，相信之前就有不少小伙伴查過很多細胞庫的很多細胞形態(tài)照片,，或許只是未注意到這種情況。這個還是非常常見的現(xiàn)象,，不代表細胞存在污染或者不純哦,。
好的，今天的細胞世界帶大家了解了球球具體是什么,，相信大家已經(jīng)非常清楚的了解到了,，之后實驗也可以更加胸有成竹了。
小尚掐指一算，肯定有很多小伙伴也想看看自己養(yǎng)的細胞到底是怎么增殖的,。上面細胞增殖視頻用到的是細胞增殖延時攝影技術(shù),，其實原理就是在一段時間內(nèi)通過顯微鏡以特定的速率（通常為幀/秒（fps））捕捉標本的圖像，最終合成一段細胞增殖的視頻,。當然大部分小伙伴應(yīng)該是用不上這個的,，不過為了滿足大家好奇心，小尚特意準備了日本JCRB細胞庫視頻查詢,，其中有600多種細胞增殖的延時攝影視頻,，有興趣的小伙伴們可以去搜搜看有沒有自己培養(yǎng)的細胞的增殖視頻。
JCRB細胞庫視頻查詢：
最后,，祝各位小伙伴培養(yǎng)的細胞越來越好,，實驗順順利利，科研路途一路坦蕩,。
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