LBA4404電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86110-01(10×100ul)/BFNC86110-02(50×100ul)

LBA4404 Elec：                                                           50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )                    10μl
保存條件(保質(zhì)期)：                                         -80℃（12個月）

基因型

Ach5 (rif^R) Ti pAL4404 (strep^R) Octopine

產(chǎn)品說明

LBA4404菌株為Ach5型背景,，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif,，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的章魚堿型Ti質(zhì)粒pAL4404,，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,，pAL4404質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移),。 pAL4404型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽：strep,，賦予LBA4404菌株鏈霉素抗性，適用于菸草,、番茄,、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。

青旗生物開發(fā)的LBA4404電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒 (size:11633 bp)檢測轉(zhuǎn)化效率>10⁵ cfu/μg DNA,；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒 (size:40 kb)檢測轉(zhuǎn)化效率可達10³ cfu/μg DNA,。

操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分,，正置5分鐘,，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,，壓實冰面,，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫,。

2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,，待其融化，加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（體積不大于6ul,，感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高,，*使用前盡量做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量），用手bo打管底混勻,，立即插入冰中,，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中,，蓋上杯蓋,，空管保留待用。

3. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF,，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦,，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作）,，將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中,，加入700 μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中,，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上,，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可,；平板中同時加入50 μg/ml kan,，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h,；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）,。

LBA4404電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞

備注

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗,；S：敏感,。）

3、LB及YEB配方：

注意事項

1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10,；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染,，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍,，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級,。

2. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量,。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足,，陽性克隆生長變慢,，菌落變小，為了獲得大的菌落,，應(yīng)減少質(zhì)粒用量,。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml,，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率,。本公司感受態(tài)計算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan,，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長,、篩選農(nóng)桿菌,；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素,，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。