本文要點(diǎn)：聚焦超聲(FUS)誘導(dǎo)的血腦屏障(BBB)的打開(kāi)是增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)治療的關(guān)鍵,。然而，一種具有高時(shí)空分辨率的體內(nèi)成像方法仍然缺乏原位同步監(jiān)測(cè)血腦屏障打開(kāi)過(guò)程,。在本文中,，作者報(bào)道了使用吲哚菁綠摻雜微泡(MBs-ICG)可視化FUS誘導(dǎo)的血腦屏障的打開(kāi)和增強(qiáng)對(duì)抗GBM的光熱治療(PTT),。MBs-ICG在第二近紅外窗口(NIR-II)顯示明亮的熒光,，超聲對(duì)比和超聲誘導(dǎo)的尺寸轉(zhuǎn)換特性。MBs-ICG利用互補(bǔ)的對(duì)比度特性,，可成功應(yīng)用于腦血管成像,，NIR-II熒光分辨率為168.9 lm，超聲穿透深度為~7mm,。作者進(jìn)一步證明MBs-ICG可以與FUS結(jié)合,，在NIR-II熒光信本比為6.2±1.2的情況下，對(duì)血腦屏障開(kāi)口進(jìn)行原位同步可視化,。最后,，作者的數(shù)據(jù)表明，在FUS照射下,，MBs-ICG轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)-icg納米顆粒,，并在10min內(nèi)迅速穿透腫瘤組織，增強(qiáng)原位GBM小鼠的PTT,。多功能MBs-ICG方法為監(jiān)測(cè)血腦屏障開(kāi)放和強(qiáng)化GBM治療提供了一種新的范例,。

背景：作者開(kāi)發(fā)了吲哚菁綠摻雜微泡作為BBB開(kāi)口的輔助試劑和用于同步可視化FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)口的NIR-II成像劑原位,，通過(guò)FUS有效打開(kāi)腫瘤BBB，增強(qiáng)原位膠質(zhì)瘤的光熱效應(yīng),。

簡(jiǎn)介：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是一種高度侵襲性和預(yù)后不良的腦腫瘤,，全qiu范圍內(nèi)五年生存率為<5%，中位總生存期為14-17個(gè)月,。GBM的治療仍然具有挑戰(zhàn)性,，因?yàn)榭拱┧幬锿ㄟ^(guò)血腦屏障（BBB）的遞送有限。微氣泡（MBs）與聚焦超聲（FUS）相結(jié)合是一種有吸引力的非侵入性方法,，用于誘導(dǎo)短暫的BBB開(kāi)放并增強(qiáng)GBM治療的藥物遞送,。與其他方法相比，這種物理方法顯示出非侵入性,，位點(diǎn)特異性和可逆性的優(yōu)點(diǎn),，例如化學(xué)處理，納米藥物遞送和光熱處理,。FUS介導(dǎo)的BBB開(kāi)口的可視化有助于提高安全性,，并闡明提高GBM治療效果的機(jī)制。目前,，幾種成像方法,，包括磁共振成像（MRI），光聲（PA）成像和單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（SPECT）成像,，已被用于監(jiān)測(cè)FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)口,。然而，這些方法通常存在需要使用輻射,、時(shí)間要求嚴(yán)格和分辨率低等問(wèn)題。

第二近紅外窗口（NIR-II,，1000-1700nm）中的熒光成像是一種*的光學(xué)成像技術(shù),，具有wu輻射，實(shí)時(shí)操作和高時(shí)空分辨率的優(yōu)點(diǎn),。它在科學(xué)研究中備受關(guān)注,，并已應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。最近,，Li等人改進(jìn)了NIR-II探針,，用于監(jiān)測(cè)FUS誘導(dǎo)的BBB的打開(kāi)和恢復(fù)，具有快速反饋和高分辨率的特點(diǎn),。然而,，作為成像探針的NIR-II納米顆粒和作為BBB開(kāi)口輔助試劑的微氣泡在體內(nèi)表現(xiàn)出不同的藥代動(dòng)力學(xué)，這使得FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)口難以同步監(jiān)測(cè),。

在這項(xiàng)工作中,，作者報(bào)道了吲哚菁綠（ICG）負(fù)載的脂質(zhì)微泡（MBs-ICG）用于FUS誘導(dǎo)的BBB打開(kāi)和原位可視化,，以及增強(qiáng)光熱療法（PTT）對(duì)GBM的作用。ICG是一種經(jīng)美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于體內(nèi)臨床應(yīng)用染料,，具有明亮的NIR-II熒光和高效的光熱性能,。MBs-ICG與FUS結(jié)合不僅可以打開(kāi)BBB，而且在FUS照射下MBs-ICG轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)-ICG納米顆粒（NPs）,，用于BBB開(kāi)口的NIR-II熒光可視化和增強(qiáng)PTT對(duì)GBM的抑制,。作者評(píng)估了MBs-ICG在正常小鼠和原位GBM小鼠模型中的成像和治療潛力，為監(jiān)測(cè)BBB開(kāi)放和加強(qiáng)GBM治療提供了一種可視化方法,。

實(shí)驗(yàn)：

1.甲基溴-ICG的制備

作者采用薄膜水化和機(jī)械振動(dòng)的方法制備了MBs-ICG,。簡(jiǎn)而言之，適量的DSPC,，DSPE-PEG2000,和ICG（摩爾比= 10：1：1）在試管中與氯仿混合,。然后，將混合溶液在N2氣體,，直到在管壁上產(chǎn)生磷脂膜,。隨后，將干燥的脂質(zhì)膜在真空下保持3-4小時(shí),。氯仿完quan揮發(fā)后,，將所得脂質(zhì)膜在TRIS緩沖液中水合。然后,，將1mL水性脂質(zhì)體懸浮液加入密封小瓶中,，用全氟丙烷 (C3F8) 氣體。最后,，將小瓶在機(jī)械搖床中機(jī)械振動(dòng)45秒,。成功制備的MBs-ICG儲(chǔ)存在冰上。整個(gè)過(guò)程是在沒(méi)有光線(xiàn)的情況下進(jìn)行的,。

2.甲基安尼加侖山甲的表征

通過(guò)熒光顯微鏡研究了MBs-ICG的表面形貌,。使用JEM-1200EX顯微鏡獲取脂質(zhì)-ICG制劑的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。使用用游離ICG制備的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量MBs-ICG中ICG的含量,。分別用分光熒光計(jì)和紫外分光光度計(jì)對(duì)相同ICG濃度的MBs-ICG和游離ICG的熒光光譜和吸收光譜進(jìn)行了表征,。MBs-ICG和脂質(zhì)-ICG的流體動(dòng)力學(xué)尺寸使用Nano-ZS90通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）進(jìn)行評(píng)估。MBs-ICG的濃度使用AccuSizer 780APS計(jì)數(shù)器測(cè)量,?；趯拵}沖法測(cè)定MB的諧振頻率。

3.MBs-ICG的體外性能

MBs-ICG和SonoVue的超聲性能使用VisualSonicsVevo 2100成像系統(tǒng)進(jìn)行了測(cè)試,。簡(jiǎn)而言之,，將MB以增加的濃度（1×104，1×105,，1×106和1×107氣泡/毫升）,。從凝膠側(cè)面采集超聲圖像,，并通過(guò)Vevo LAB軟件分析超聲信號(hào)強(qiáng)度。市售的SonoVue MB作為對(duì)照,。通過(guò)體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)和NIR-II熒光成像系統(tǒng)獲取不同濃度的MBs-ICG和脂質(zhì)-ICG（MBs-ICG碎裂）溶液的NIR-I/NIR-II窗口中的熒光圖像,。

4.體外光熱效應(yīng)

使用近紅外熱像儀研究了PBS和MBs-ICG的光熱特性。首先,，將溶液中的100μL加入管帽中,，并用808nmNIR激光器處理180秒，在激光照射期間,，成像儀相機(jī)將自動(dòng)記錄溶液中的溫度變化并提供實(shí)時(shí)熱成像,。最后，得到不同時(shí)間間隔的樣品溶液的光熱加熱曲線(xiàn),。

5.細(xì)胞培養(yǎng)

熒光素酶標(biāo)記的GL261 GBM細(xì)胞系（GL261-Luc）和bEnd.3腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系取自美國(guó)型培養(yǎng)物保藏（ATCC）,。將細(xì)胞在完quan高糖DMEM中培養(yǎng)，其中包含10%熱滅活FBS,，90%基礎(chǔ)DMEM和青霉素-鏈霉素,，后者在使用前制備。此外,，胰蛋白酶-EDTA用于消化細(xì)胞,，PBS緩沖液用于洗滌細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)按復(fù)蘇,、傳代和冷凍保存過(guò)程進(jìn)行,。允許細(xì)胞在含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)在37°C。所有細(xì)胞操作均無(wú)菌進(jìn)行,。

6.動(dòng)物模型

所有動(dòng)物試驗(yàn)均獲得深圳市*技術(shù)研究院和中科院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn),。雌性C57BL/6J小鼠（6-8周）從北京維塔爾河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司（中國(guó)）獲得。所有小鼠都可以免費(fèi)攝入標(biāo)準(zhǔn)飼料和無(wú)菌水,。構(gòu)建腦鏡灌注成像顱窗模型,。與軟組織的深度穿透相反，由于超聲能量的強(qiáng)烈衰減,，顱骨存在的超聲穿透受到限制,。簡(jiǎn)而言之,，在深度麻醉的小鼠中鉆出直徑在5-6mm范圍內(nèi)的顱骨孔,，而沒(méi)有腦組織出血或損傷。在手術(shù)過(guò)程中,，頭骨撒上鹽水溶液以保持清潔并保持低溫,，同時(shí)給予利duo卡因以緩解疼痛。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,，對(duì)小鼠進(jìn)行保溫和抗炎治療,，并定期監(jiān)測(cè)其生命體征,。

通過(guò)將GL261-Luc細(xì)胞原位注射到小鼠腦紋狀體中建立原位GBM模型。簡(jiǎn)而言之,，脫毛后,，用異氟醚氣體麻醉小鼠，并將頭部固定在立體定向裝置上（RWD生命科學(xué),，中國(guó)深圳）,。在對(duì)皮膚進(jìn)行消毒并做切口后，將微量注射器定位在腦組織上（前膛：3.0毫米,，矢狀縫合線(xiàn)：2.0毫米,，深度：3.5毫米）。隨后,，大約 5.0 × 105在5分鐘內(nèi)緩慢注射5μL中的GBM細(xì)胞以保持顱內(nèi)壓穩(wěn)定,。通過(guò)生物發(fā)光成像和H&E染色檢測(cè)顱內(nèi)GBM細(xì)胞的增殖。

7.體內(nèi)超聲灌注成像

腦脈管系統(tǒng)的超聲圖像是通過(guò)鉆孔窗口獲得的,，使用配備18MHz高頻換能器的 VisualSonics Vevo 2100 成像系統(tǒng),。在將換能器放在頭部之前，將偶聯(lián)劑輕輕地涂在顱窗上,。注射MBs-ICG后（200μL的1×109氣泡/mL）,，超聲成像的實(shí)時(shí)性允許在30分鐘內(nèi)可視化流經(jīng)大腦微脈管系統(tǒng)的MB。重要的是,，成像參數(shù)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持一致,。此外，通過(guò)成像系統(tǒng)記錄和分析不同時(shí)間點(diǎn)的超聲灌注圖像,。從B模式成像數(shù)據(jù)分析顏色編碼的參數(shù)圖像以顯示腦灌注,。

8.腦血管系統(tǒng)的NIR-II熒光成像

脫毛后，將小鼠置于俯臥位,，并通過(guò)尾靜脈注射MBs-ICG或游離ICG（ICG劑量=1.5mg/kg）,。使用NIR-II熒光成像系統(tǒng)（以不同的時(shí)間間隔獲取具有完整顱骨的腦血管結(jié)構(gòu)的NIR-II熒光圖像)。

9.FUS誘導(dǎo)的BBB通路

超聲刺激由頻率為1 MHz的FUS換能器產(chǎn)生,，該換能器由超聲神經(jīng)刺激儀器驅(qū)動(dòng),。換能器和顱骨之間的空間充滿(mǎn)了無(wú)氣泡偶聯(lián)劑，以zui大限度地提高超聲傳輸,。使用準(zhǔn)直器引導(dǎo)FUS光束聚焦在參考點(diǎn)上（前膛：3.0毫米,，矢狀縫合線(xiàn)：2.0毫米，深度：3.5毫米）,。通過(guò)觀察通過(guò)尾靜脈向小鼠施用Evans Blue染料（劑量=0.1mg/kg）后腦組織是否染有藍(lán)色斑點(diǎn)來(lái)判斷BBB的開(kāi)口,，并在2小時(shí)后處死小鼠。FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)口的安全性通過(guò)H&E和TUNEL染色確定。

10.FUS誘導(dǎo)BBB開(kāi)口的NIR-II.熒光成像

使用暴露的剃光頭的健康C57BL / 6J小鼠監(jiān)測(cè)FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)放過(guò)程,。靜脈注射MBs-ICG后（1×109氣泡/mL）,，麻醉小鼠在不同聲壓（0.28、0.36和0.46MPa）下用FUS以1 MHz頻率刺激2min,。超聲超聲處理的脈沖長(zhǎng)度為10ms,，脈沖重復(fù)頻率為1Hz。使用體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)（Ex,，745 nm;Em,，840 nm）和NIR-II熒光成像系統(tǒng)（Ex，808nm;長(zhǎng)通濾光片,，1300nm;曝光時(shí)間,，200ms;功率密度，60mW/cm2）,，分別,。在FUS超聲處理后0、3,、10,、15、30,、45,、60、90和120分鐘捕獲圖像,。在這兩種模式下采集的圖像分別使用IVIS活體圖像軟件和ImageJ軟件進(jìn)行處理,。

11.體內(nèi)PTT

為了獲得MBs-ICG的體內(nèi)PTT能力，將攜帶GL261-Luc GBM的小鼠隨機(jī)分為三組（每組5只）：（一）PBS激光;（二）甲基溴-ICG激光;（三）MBs-ICG-FUS-激光器,。腦腫瘤的位置由808nm激光（1W/cm）照射2,，5分鐘）注射后5分鐘。在5分鐘內(nèi),，紅外熱像儀（Ti27,，美國(guó)福祿克）捕獲了照射部位的溫度變化。此外,，在激光照射后12小時(shí)處死攜帶GBM的小鼠,，并收集腦組織進(jìn)行H&E和TUNEL染色。

12.體外毒理學(xué)

通過(guò)將bEnd.3細(xì)胞與MBs-ICG（ICG濃度范圍為6.25至100μg/ mL）孵育24小時(shí)來(lái)評(píng)估MBs-ICG的細(xì)胞毒性,。CCK-8測(cè)定用于確定孵育后的細(xì)胞活力,。此外，從小鼠血液中獲得的紅細(xì)胞與MBs-ICG（與上述ICG濃度相同）一起孵育以確定溶血率,。在37°C孵育3小時(shí)后,，用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度，并計(jì)算不同組的溶血率,。

13.體內(nèi)毒性

為了評(píng)估MBs-ICG的生物安全性,，將健康小鼠隨機(jī)分為四組（每組5組）：（一）空白對(duì)照（PBS）;（二）甲基溴-ICG注射后一維;（三）甲基溴-ICG注射后的三維;（四）甲基溴-ICG注射后5-d。在所有實(shí)驗(yàn)中,，MBs-ICG的ICG劑量為1.5mg/kg,。經(jīng)過(guò)上述處理后，收集血液樣本進(jìn)行常規(guī)血液檢查,。最后,，收集小鼠的主要器官（心臟，肝臟,，脾臟,，肺和腎臟）進(jìn)行H&E染色。

結(jié)果：

1.甲基溴-ICG的制備和表征

薄膜水合法用于制備MBs-ICG,，使用FDA批準(zhǔn)的賦形劑,，包括DSPC，DSPE-PEG2000,、ICG和C3F8氣體（圖1a）,。熒光顯微鏡圖像顯示MBs-ICG分散良好，具有核/殼結(jié)構(gòu)（暗C3F8 氣體核心和脂質(zhì)殼表現(xiàn)出明亮的熒光）（圖1b）,。使用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量MBs-ICG的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑,，導(dǎo)致1.0±0.17μm（圖1c），小于商業(yè)MB的直徑（例如SonoVue,，尺寸= 2.5μm）,。為了優(yōu)化MBs-ICG的光學(xué)性能，作者研究了摻雜ICG濃度對(duì)MBs-ICG熒光強(qiáng)度的影響,。zui大化ICG熒光并減少聚集誘導(dǎo)熒光猝滅的zui 好的ICG濃度為1μg/ mL（圖1d）,。其次，測(cè)量了MBs-ICG和游離ICG的吸收光譜,，結(jié)果表明,，與游離ICG相比，MBs-ICG的吸收峰表現(xiàn)出從783 nm到785 nm的紅移,。在MBs-ICG的NIR-II窗口中檢測(cè)到典型的拖尾熒光發(fā)射（圖1e）,。與相同濃度下的游離ICG相比，MBs-ICG的NIR-II強(qiáng)度提高了13.4%,。一個(gè)可能的原因是,，疏水單層MBs中的ICG重排抑制了ICG的分子聚集并增強(qiáng)了其熒光發(fā)射。最后,，采用功率密度為1 W/cm的808 nm激光器照射,，研究了MBs-ICG的光熱性能2.MBs-ICG的光熱溫度在3 min內(nèi)提高了39.4°C（圖1f）,，顯示出良好的光熱性能。

圖1

2.MBs-ICG的超聲和熒光特性

ICG摻雜到MB的脂質(zhì)層中賦予它們超聲波和熒光特性,。首先,，作者使用Vevo 2100高分辨率成像系統(tǒng)評(píng)估了MBs-ICG的超聲特性，該系統(tǒng)顯示出濃度依賴(lài)性對(duì)比度增強(qiáng)（圖2a）,。MBs-ICG的圖像對(duì)比度與商業(yè)微泡相當(dāng)（SonoVue,，2.5μm）。然而,，MBs-ICG（～1 MHz）的諧振頻率低于SonoVue（1.48–1.89 MHz）（圖2b）,。MBs-ICG頻率的降低保證了超聲成像和治療的高組織滲透性和良好的生物安全性[38]。在頻率為1 MHz的超聲處理1 min后,，MBs-ICG轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)-ICG NPs,。TEM和DLS測(cè)量表明，所得脂質(zhì)-ICG NPs為球形,，平均流體動(dòng)力學(xué)直徑為～147 nm（圖2c）,。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，脂質(zhì)-ICG NPs的熒光在di一個(gè)近紅外（NIR-I,，650–950 nm）窗口和NIR-II窗口與MBs-ICG相比沒(méi)有衰減（圖2d和e）,。這允許對(duì)具有深層組織穿透力（～8 mm）的MBs-ICG進(jìn)行NIR-II熒光成像（圖2f和圖）。S5在線(xiàn)）,。綜上所述,，本研究制備的MBs-ICG具有良好的超聲和熒光對(duì)比度以及超聲誘導(dǎo)的尺寸轉(zhuǎn)化特性。

圖2

3.腦血管系統(tǒng)的雙模態(tài)成像

MBs-ICG優(yōu)異的體外超聲和NIR-II熒光性能允許進(jìn)一步評(píng)估小鼠模型中的體內(nèi)雙模態(tài)成像,。在MBs-ICG處理組中,，用明亮的NIR-II熒光觀察到腦血管結(jié)構(gòu)，包括腦下靜脈和頭皮下的腦毛細(xì)血管,，但在游離ICG處理組中則未觀察到（圖3a和圖）,。S6在線(xiàn)）。MBs-ICG處理小鼠的成像時(shí)間窗口達(dá)到30分鐘,，而游離ICG處理小鼠的相應(yīng)值僅為5分鐘,。來(lái)自MBs-ICG處理的小鼠的腦血管系統(tǒng)圖像的高斯擬合在治療后1分鐘提供了高達(dá)168.9μm的血管分辨率（圖3b），為高分辨率腦血管成像提供了機(jī)會(huì),。接下來(lái),，我們進(jìn)一步采用MBs-ICG的超聲灌注成像來(lái)可視化顱窗小鼠模型中的腦脈管系統(tǒng)。MBs-ICG的成像時(shí)間窗口保持>30 min,，成像深度達(dá)到～7 mm（圖3c和d）,，與NIR-II熒光成像相似。然而,，由于超聲成像的分辨率低,，很難wu創(chuàng)地獲得腦血管結(jié)構(gòu)的圖像,。綜上所述，這些結(jié)果揭示了本研究制備的MBs-ICG在互補(bǔ)NIR-II熒光和超聲腦血管成像方面的優(yōu)勢(shì),。

圖3

4.MBs-ICG結(jié)合FUS進(jìn)行BBB開(kāi)口

MBs-ICG與FUS的組合用于小鼠模型中的BBB打開(kāi)（圖4a）,。在這里，我們描述了遵循的一般程序,。靜脈注射MBs-ICG后對(duì)小鼠大腦進(jìn)行超聲處理2分鐘（～1×109氣泡/毫升）。通過(guò)EB染色確認(rèn)BBB的開(kāi)放區(qū)域,，并在腦組織的病理切片中評(píng)估超聲處理過(guò)程的安全性,。首先，使用校準(zhǔn)的0.5毫米針式水聽(tīng)器研究了顱骨厚度對(duì)局灶性FUS區(qū)域的影響[39],。如圖4b所示,，在沒(méi)有頭骨的情況下，焦點(diǎn)直徑為～2.5 mm,，在存在0.5 mm小鼠頭骨的情況下,，只有微小的尺寸和形狀變形（圖4c）。這一結(jié)果表明,，小鼠頭骨不影響B(tài)BB開(kāi)口范圍,。接下來(lái)，我們采用EB染色來(lái)檢測(cè)BBB滲透率[40],，[41],，[42]。MBs-ICG-FUS處理組在右半球顯示一個(gè)藍(lán)點(diǎn),，在FUS處理組中不存在,，表明成功定位BBB開(kāi)口（圖4d）。此外,，腦切片分析表明,，BBB開(kāi)口深度可以穿透整個(gè)腦組織（圖4e）。最后,，腦組織的H&E染色分析顯示FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)放后沒(méi)有出血,，紅細(xì)胞外滲或損傷（圖4f）。這些結(jié)果表明,，MBs-ICG與FUS相結(jié)合可以以非侵入性,，特定地點(diǎn)和高度安全的方式打開(kāi)BBB。

圖4

5.FUS誘導(dǎo)BBB開(kāi)口的體內(nèi)NIR-II.熒光成像

在FUS照射下,，MBs-ICG轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)-ICG NPs（圖2 c）,，這為使用脂質(zhì)-ICG NPs的NIR-II熒光原位可視化BBB開(kāi)口提供了ji好的機(jī)會(huì)（圖2d和e）。如圖5a所示,，NIR-II熒光在FUS處理區(qū)域立即增加,。30分鐘時(shí),，NIR-II熒光的信噪比（SBR）為6.2±1.2，比NIR-I熒光成像的信噪比（SBR = 1.4 ± 0.4）高約3.5倍（圖5b）,。結(jié)果表明,，脂質(zhì)-ICG NPs產(chǎn)生的NIR-II熒光在FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)口的原位同步監(jiān)測(cè)方面優(yōu)于NIR-I熒光[43]。離體腦NIR-II和NIR-I熒光成像進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果（圖5c和d）,。值得注意的是,，在FUS誘導(dǎo)的BBB打開(kāi)和監(jiān)測(cè)過(guò)程中僅使用了MBs-ICG，與以前的報(bào)告相比,，這大大降低了操作的復(fù)雜性[18],。接下來(lái)，作者移動(dòng)超聲換能器（右,，左和兩側(cè)）并改變聲壓（0.28,，0.36和0.46 MPa）以控制FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)口的位置和范圍。使用NIR-II熒光成像測(cè)量FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)口的直徑,，在三種不同的實(shí)驗(yàn)條件（0.28,，0.36和0.46 MPa）下分別得到1.48，1.79和2.49mm（圖5e和f）,。此外,，通過(guò)對(duì)FUS處理的腦組織的H&E和TUNEL染色分析未檢測(cè)到組織損傷，出血或凋亡,，顯示出FUS聯(lián)合MBs-ICG用于BBB開(kāi)口的良好安全性能,。

圖5

6.GBM的體內(nèi)PTT

MBs-ICG與FUS相結(jié)合，不僅可以用于原位打開(kāi)和同步可視化BBB,，還可以對(duì)GBM進(jìn)行PTT,。建立原位GBM小鼠模型以評(píng)估MBs-ICG的PTT電位（圖6a）。生物發(fā)光成像和H&E染色分析顯示GBM細(xì)胞在荷瘤小鼠中的增殖活性增加（圖6b和c）,。將GBM荷瘤小鼠隨機(jī)分為兩組（每組5只）,，如下所示：（i）MBs-ICG;（二） 甲基溴-ICG-FUS。如圖6 d所示,，在MBs-ICG處理組的腦腫瘤區(qū)域未觀察到NIR-II熒光的顯著增強(qiáng),，而在MBs-ICG-FUS組小鼠的腫瘤部位在10分鐘內(nèi)檢測(cè)到強(qiáng)烈的NIR-II熒光.腦組織的離體NIR-II熒光成像進(jìn)一步證實(shí)信號(hào)來(lái)自腫瘤組織（圖6這一結(jié)果表明，由于大小限制,，MBs-ICG無(wú)法進(jìn)入腦腫瘤,。然而，MBs-ICG在FUS照射下轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)-ICG NPs可以增強(qiáng)其在腦腫瘤中的穿透和積累能力,。值得注意的是,，所提出的方法需要<10分鐘才能將光熱試劑遞送到腫瘤組織，這將比以前的方法更有效,。接下來(lái),，靜脈注射MBs-ICG后,，進(jìn)一步獲得原位GBM小鼠的PTT效率。在FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)口（808 nm,，1 W / cm）后,，作者使用NIR激光照射原位GBM區(qū)域5分鐘2).通過(guò)紅外熱像儀監(jiān)測(cè)不同處理過(guò)程中GBM區(qū)域的溫度變化。如圖6f所示,，PBS激光組和MBs-ICG激光治療組的GBM區(qū)域溫度達(dá)到39-41°C,。這樣的溫度低于42°C，無(wú)法產(chǎn)生可以殺死癌細(xì)胞的熱療,。然而,，在MBs-ICG-FUS-激光組中，在激光照射的5分鐘內(nèi),，腦腫瘤區(qū)域的溫度從31.5°C迅速升高到50.6°C,。其次,，通過(guò)腦組織的TUNEL染色分析評(píng)估MBs-ICG的光熱功效,。如圖6克，MBs-ICG-FUS激光組的腫瘤組織損傷和細(xì)胞壞死比其他組更嚴(yán)重,。這些結(jié)果表明,，MBs-ICG聯(lián)合FUS可作為治療小鼠模型GBM的有效熱療方法。

圖6

7.甲基溴-ICG的毒性評(píng)價(jià)

作者首先使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8來(lái)確定MBs-ICG對(duì)bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,。用不同濃度的MBs-ICG孵育24小時(shí)后,，細(xì)胞活力保持在90%以上，表明MBs-ICG細(xì)胞毒性低,。還使用小鼠來(lái)源的紅細(xì)胞測(cè)量細(xì)胞溶血率,。當(dāng)MBs-ICG濃度達(dá)到100μg/mL時(shí)，觀察到3%的溶血率,，表明血液相容性良好,。接下來(lái)，作者進(jìn)一步評(píng)估了MBs-ICG在C57BL / 6J小鼠模型中的體內(nèi)毒性,。靜脈注射濃度為～1×10的MBs-ICG后9氣泡/mL,，在第1、3和5天采集血樣進(jìn)行常規(guī)血液檢查,。所有血液學(xué)指標(biāo),，包括紅細(xì)胞、HGB,、周一,、格蘭、白細(xì)胞,、淋巴,、HCT,、MCV、MCH,、MCHC,、PLT 和 RDW。在正常范圍內(nèi),，表明MBs-ICG未引起小鼠急性毒性,。此外，MBs-ICG處理的小鼠在靜脈注射MBs-ICG后24小時(shí)被安樂(lè)si,，并通過(guò)H&E染色分析其主要器官,，包括心臟，肝臟,，脾臟和肺,。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比,，MBs-ICG未導(dǎo)致主要器官的形態(tài)變化,。綜上所述，MBs-ICG具有優(yōu)異的生物相容性,，顯示出廣闊的臨床應(yīng)用潛力,。

討論：作者采用薄膜水合法制備了具有NIR-II熒光、超聲對(duì)比度和超聲響應(yīng)特性的MBs-ICG,。MBs-ICG可用于小鼠模型中腦血管結(jié)構(gòu)的高分辨率NIR-II熒光成像和深度超聲成像,。MBs-ICG和FUS的組合以受控和位點(diǎn)特異性的方式打開(kāi)小鼠的BBB，并且該過(guò)程可以通過(guò)NIR-II熒光原位同步可視化,。這種簡(jiǎn)單有效的技術(shù)也可用于小鼠模型中腦腫瘤的PTT,。為治療診斷MBs-ICG為可視化FUS誘導(dǎo)的BBB開(kāi)放和腦腫瘤的光療提供了一種新工具。

參考文獻(xiàn)

Liang, S.; Hu, D.; Li, G.; Gao, D.; Li, F.; Zheng, H.;Pan, M.; Sheng, Z., NIR-II fluorescence visualization of ultrasound-inducedblood-brain barrier opening for enhanced photothermal therapy againstglioblastoma using indocyanine green microbubbles. Sci Bull (Beijing) 2022,67 (22), 2316-2326.

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