本文要點(diǎn)：詳細(xì)描述微血管改變需要能夠提供形態(tài)和功能信息的高分辨率3D成像方法。現(xiàn)有的光學(xué)顯微鏡工具通常用于微血管造影,，但在可實(shí)現(xiàn)的視野和空間分辨率之間提供了次優(yōu)的權(quán)衡，生物組織中的強(qiáng)光散射進(jìn)一步限制了可實(shí)現(xiàn)的穿透深度,。本文介紹了一種基于立體視覺結(jié)合超分辨率定位成像的體積深部組織微血管造影新方法,，該方法克服了寬場成像結(jié)構(gòu)中光擴(kuò)散和光學(xué)衍射對空間分辨率的限制,。該方法利用了第二個(gè)近紅外窗口（NIR-Ⅱ，≈1000-1700 nm）中流動熒光顆粒的定位和跟蹤,，并通過三角測量和立體匹配兩個(gè)在雙視圖模式下運(yùn)行的短波紅外相機(jī)獲取的圖像來增加第三（深度）維度,。所提出的方法啟用的3D成像功能有助于微血管網(wǎng)絡(luò)的詳細(xì)可視化和精確的血流定量。在組織模擬模型中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明,，在渾濁介質(zhì)中,，高分辨率可保存至4毫米的深度。整個(gè)小鼠皮層和穿透血管的經(jīng)顱微血管造影在毛細(xì)血管水平分辨率下進(jìn)一步顯示,。

背景：微循環(huán)的形態(tài)和功能變化與許多病理的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),。激光散斑對比成像（LSCI）根據(jù)紅細(xì)胞運(yùn)動引起的斑點(diǎn)圖案波動提供了二維動態(tài)血流灌注圖。但LSCI覆蓋的深度范圍非常淺,，散斑模型的模糊性進(jìn)一步阻礙了血流速度的量化,。多光子顯微鏡利用其非線性激發(fā)機(jī)制產(chǎn)生的光學(xué)切片能力，得益于共聚焦,，3D成像可以通過沿深度的機(jī)械物鏡平移,，可調(diào)焦鏡頭，遠(yuǎn)程聚焦,，或混響光學(xué)環(huán)實(shí)現(xiàn),，此外，線掃描可以探測流速,，但jin限于小視場（FOV） 內(nèi)的預(yù)選血管中,，通常為＜1毫米。光學(xué)相干斷層掃描已用于更深深度（≈1-2 mm）的微血管造影成像,，通過檢測連續(xù)B掃描之間的振幅去相關(guān),。光學(xué)顯微鏡方法所能達(dá)到的有限的深度和視場，促進(jìn)了基于超聲（US）和光聲學(xué)（OA）的新的深部組織成像方法的發(fā)展,。與軟生物組織中的光子相比,，利用超聲波的微不足道的散射，這些方法實(shí)現(xiàn)了幾mm到cm深度的高分辨率成像,。超聲定位顯微鏡進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了驚人的分辨率增強(qiáng)（≈十倍）和并通過跟蹤靜脈注射的微泡同時(shí)測量平面內(nèi)速度,。能夠檢測1000-1700 nm波長范圍內(nèi)的光子的高效短波紅外（SWIR）相機(jī)的出現(xiàn)為在第二個(gè)近紅外（NIR-II）窗口中捕獲彈道光子開辟了一條新途徑，該窗口具有減少的光散射和自發(fā)熒光,。寬場,，共聚焦和光片顯微鏡NIR-II成像顯著增強(qiáng)了成像深度，相對于在可見光或di一近紅外（NIR-I）光譜下操作的其他光學(xué)方法所能達(dá)到的深度,。具有高量子效率的NIR-II造影劑的開發(fā)進(jìn)一步促進(jìn)了深層組織成像,。在本文在NIR-II窗口中提出了一種新的基于立體視覺的體積深部組織成像方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)小鼠大腦的3D經(jīng)顱超分辨率微血管造影。

研究內(nèi)容：

1,、系統(tǒng)設(shè)計(jì)和表征：擬議系統(tǒng)的示意圖表示如圖1a所示,。外照射由855 nm激光二極管提供，而兩個(gè)相同的SWIR相機(jī)用于以立體視角±20°的雙視角模式收集發(fā)射的熒光信號,。對于這種布置,，位于不同深度的熒光目標(biāo)被投射在兩個(gè)傳感器上的不同位置。這些投影中的每一對點(diǎn)都可以對分離的熒光發(fā)射器進(jìn)行3D定位,。具體來說,，點(diǎn)之間的橫向偏移，即所謂的視差,，編碼發(fā)射器在感興趣體積（VOI）中的軸向位置,，根據(jù)立體視覺參數(shù)對其進(jìn)行三角測量（圖1b）。利用流動熒光微滴的稀疏性,，在相機(jī)采集的每張圖像中以亞像素分辨率定位其中心,。接下來是搜索圖像校正后位于相似水平坐標(biāo)的匹配點(diǎn)對。通過3D跟蹤算法建立的流動目標(biāo)軌跡疊加,，最終呈現(xiàn)出體積圖像（圖1b）,。與其他基于定位的成像方法一樣，如光激活定位顯微鏡或隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡,，所提方法的理論分辨率受到定位精度的限制,。后者是通過在平面顯微載玻片上以40 Hz幀速率渲染靜態(tài)微液滴的雙視圖圖像堆棧來估計(jì)的，總采集時(shí)間為50 s,。液滴局部位置的變化有助于估計(jì)zui大可實(shí)現(xiàn)的分辨率（圖1c）,。請注意，微滴的尺寸小于光學(xué)系統(tǒng)的衍射極限,，即在當(dāng)前設(shè)置下為≈27.7μm,，也就是說，它可以有效地被認(rèn)為是理想的點(diǎn)源,。假she,，局部點(diǎn)的分布由高斯函數(shù)很好地近似,，則相應(yīng)的全半寬zui大值 （FWHM） 在x,、y和z方向上分別為1.3、1.5和3.4 μm（圖1d）,。請注意,，定位精度取決于信噪比（SNR），對于較大的微液滴,，信噪比更高,。通過獲取平面棋盤圖案的明場圖像堆棧，進(jìn)一步驗(yàn)證了整個(gè)FOV的系統(tǒng)性能，該圖像使用電動載物臺在3 mm深度范圍內(nèi)沿z軸以5μm步長平移（圖1e）,。黑白方塊之間的交叉點(diǎn)在每個(gè)深度上定位,，在圖1f中繪制為具有顏色編碼深度的點(diǎn)云。圖1g所示的相鄰平面之間估計(jì)深度偏移的直方圖的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）為4.8±1.4μm,，與掃描步驟相匹配,。為了提高深度靈敏度，需要擴(kuò)大立體視覺角度,，以增加樣品在深度方向上的給定偏移引起的雙視圖之間的差異但是,，增加角度會導(dǎo)致由每個(gè)相機(jī)的景深定義的兩個(gè)體積之間的傾斜，從而導(dǎo)致雙視圖提供的體積之間的重疊減少,。為了平衡深度靈敏度和有效成像體積,，因此選擇了±20°立體視角。這些表征測量表明,，我們的方法原則上可以達(dá)到比毛細(xì)血管尺寸更好的空間分辨率,，毛細(xì)血管尺寸對應(yīng)于可以通過血液中的粒子跟蹤成像的最小結(jié)構(gòu)。

圖1

2,、散射介質(zhì)中的三維成像性能：我們的方法在散射介質(zhì)中可視化結(jié)構(gòu)的能力首ci在組織模擬成像中得到評估,。作為原理的初步證明，我們對浸入1.2%脂質(zhì)內(nèi)溶液（圖2a）的微管進(jìn)行成像,，并將其傾斜,，使模型內(nèi)部的深度沿y軸呈恒定梯度增加。選擇脂質(zhì)內(nèi)濃度來模擬生物組織中散射系數(shù)的降低,。通過將微液滴（直徑<20μm）以恒定流速注入管道進(jìn)行體積成像,。以18 Hz幀速率記錄了總持續(xù)時(shí)間為1分鐘的雙視圖圖像堆棧。通過疊加所有記錄的幀并用青色和紅色疊加在一起來獲得每個(gè)相機(jī)的寬場等效圖像（圖2b）,。沿著深度梯度,，寬場等效圖像的信噪比和分辨率迅速惡化，而雙視圖之間的位移表現(xiàn)出預(yù)期的線性增加,。通過立體視覺定位單個(gè)流動微液滴的3D位置,，重建了微管的體積視圖（圖2c）。圖2d顯示了相機(jī)1的2D寬場等效圖像與使用定位方法重建的側(cè)視圖之間的比較,，說明后者明顯提高了散射介質(zhì)中可實(shí)現(xiàn)的空間分辨率,。正如預(yù)期的那樣，還觀察到計(jì)算的深度與沿y軸的橫向位移之間的近似線性關(guān)系（圖2e）,。此外,，在脂質(zhì)內(nèi)模型（圖2f）中，不同深度重建的微管的線條輪廓在4 mm深度幾乎不受影響,，證實(shí)了所提出的系統(tǒng)的深層組織成像能力,。我們用復(fù)雜的血管形狀樣品進(jìn)一步評估了我們方法的3D性能,。具體來說，將形成結(jié)圖案的管道浸入1.2%脂質(zhì)內(nèi)溶液中的≈2毫米深度,。在注射微液滴后,，使用與直微管相同的參數(shù)進(jìn)行雙視圖記錄。通過疊加所有采集的幀來呈現(xiàn)來自每個(gè)相機(jī)的寬場等效圖像如圖2g所示,，用青色和紅色編碼,。在重建的圖像中清楚地解析了結(jié)的3D形狀（圖2h）。此外,，微管重疊段的239.4μm深度差,，與其外徑非常匹配，可以從側(cè)視圖區(qū)分開來（圖2i）,。

圖2

3,、大腦微循環(huán)的體內(nèi)經(jīng)顱圖譜：接下來，我們展示了所提出的方法在體內(nèi)小鼠皮質(zhì)脈管系統(tǒng)經(jīng)顱成像的能力,。通過3D追蹤流動的微液滴獲得深度分辨微循環(huán)圖（圖3a）,。請注意，從圖像中心到邊緣觀察到的深度梯度是由于小鼠大腦的曲率（圖3a）,?？梢娚疃冗_(dá)600μm的穿透小動脈和小靜脈，如所選VOI的放大視圖所示,，大約Bregma -1.5 mm（圖3b）,。來自三個(gè)視圖的相同VOI的血流速圖也通過微滴跟蹤呈現(xiàn)（圖3c）。圖3d顯示了通過選定VOI穿透血管跟蹤的單個(gè)微液滴的代表性延時(shí)雙視圖圖像,。首先,，兩個(gè)圖像中液滴的兩個(gè)投影之間的間隔距離減小，然后略有增加,，這與局部3D位置觀察到的深度變化一致（圖3e）,。作為交叉驗(yàn)證，通過考慮局部光斑尺寸對深度相關(guān)光擴(kuò)散的依賴性,，也使用單相機(jī)估計(jì)了同一微液滴的深度,。雖然我們的雙相機(jī)系統(tǒng)（基于立體視覺）和單相機(jī)系統(tǒng)（基于擴(kuò)散）的深度估計(jì)總體上非常一致（圖3f），但使用單相機(jī)系統(tǒng)在測量的深度中觀察到更大的波動,，這可能是由于生物組織的未知和異質(zhì)散射特性,。我們的技術(shù)實(shí)現(xiàn)的深度分辨能力進(jìn)一步提供了基于3D跟蹤的總微滴速度的更準(zhǔn)確的估計(jì)，特別是在穿透血管中（圖3g）,。

圖3

總結(jié)：體積定位顯微血管造影提供的優(yōu)勢可以極大地促進(jìn)微血管形態(tài)和循環(huán)的表征,。本文所提出的技術(shù)能夠在以前光學(xué)方法無法達(dá)到的分辨率深度范圍內(nèi)表征體內(nèi)微血管結(jié)構(gòu),。其相對簡單的實(shí)施非常適合在生物醫(yī)學(xué)研究界廣泛傳播,。評估皮質(zhì)微血管的已證明性能與研究中風(fēng)和神經(jīng)退行性疾病的根本原因和影響特別相關(guān),。此外，該方法可用于提高我們對微循環(huán)變化在癌癥,，糖尿病,，心血管疾病和其他病理狀況中的作用的認(rèn)識。

參考文獻(xiàn)

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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī),，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭,，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命,、一區(qū)熒光成像,、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng),，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司,，專注于近紅外二區(qū)成像技術(shù)。致力于為生物醫(yī)學(xué),、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供*的,、一體化的成像解決方案。自主研發(fā)近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS,。

          與基于可見光波長的傳統(tǒng)成像技術(shù)相比,，我們的技術(shù)側(cè)重于X射線、紫外,、紅外,、短波紅外、太赫茲范圍,，可為腫瘤學(xué),、神經(jīng)學(xué)、心血管,、藥代動力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果,，助力科技研發(fā)。

          同時(shí),，恒光智影還具備探針研發(fā)能力,，我們已經(jīng)成功研發(fā)了超過15種探針，這些探針將廣泛地應(yīng)用于眾多生物科技前沿領(lǐng)域的相關(guān)研究中,。