本文要點：高空間分辨率、低背景和深層組織穿透力使近紅外II（NIR-II）熒光成像成為體內(nèi)觀察和測量的最關(guān)鍵工具之一。然而，合成NIR-II熒光團相對較短的保留時間和潛在的毒性限制了其長期應用。本文報告了紅外熒光蛋白（iRFP）作為體外和體內(nèi)NIR-II探針的使用，允許長時間的連續(xù)成像（長達15個月）,。作為一個代表性的例子，將iRFP713敲入小鼠基因組以產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)基因模型,，允許探針在時間和/或空間表達控制,。為了證明其在真正的診斷環(huán)境中的可行性，采用了兩種肝臟再生模型,，并成功跟蹤了一周的過程,。性能和監(jiān)測效果與μCT相當，優(yōu)于吲哚菁綠染料,。盡管胰腺的位置很深,，但也能有效地觀察到生理和病理條件下的胰腺。這些結(jié)果表明,，iRFP輔助的NIR-II熒光系統(tǒng)適用于監(jiān)測各種組織和體內(nèi)生物過程,，提供了一個強大的wu創(chuàng)長期成像平臺。

背景：熒光成像是在活體結(jié)構(gòu)和功能研究中應用zui廣泛的技術(shù)之一,。使用第二近紅外區(qū)域(NIR-II, 900-1880nm)成像能夠以令人印象深刻的清晰度直接可視化和實時監(jiān)測深層生物結(jié)構(gòu)和過程,。迄今為止，稀土摻雜納米顆粒(RENPs),，量子點(QDs)和某些有機熒光染料已被開發(fā)用于多功能生物醫(yī)學成像中的NIR-II熒光探針,。然而，由于它們是化學合成的,，這些探針受到嚴重的限制,，包括它們在生命系統(tǒng)中bu可再生，并可能存在潛在的生物毒性風險,。在細胞分裂過程中,，這種探針在兩個子細胞之間的分割將導致信號衰減,，導致在多次細胞復制后探針不再被檢測到。此外,，合成探針可以通過體內(nèi)的生物過程快速分解或消除,，根據(jù)類型，外源性熒光探針可能表現(xiàn)出一定程度的細胞毒性,。因此,，這些探頭不適用于長時間成像。作為一種替代且更具生物相容性的選擇,，熒光蛋白（FPs）在長期監(jiān)測中比化學合成探針具有很大的優(yōu)勢,。已報道了多條近紅外FP線。其中,，紅外熒光蛋白（iRFP）系列,，包括iRFP670,、iRFP682,、iRFP702、iRFP713和iRFP720,，在近紅外波長下具有發(fā)射和激發(fā)光譜,。iRFP是杜鵑假單胞菌細菌植物色素的工程版本，可實現(xiàn)wu創(chuàng)和長期體內(nèi)可視化,。然而,，到目前為止，只有NIR-I區(qū)域被開發(fā),。為了探索iRFP在NIR-II區(qū)域的應用,，本文研究證明了iRFP713通過非峰值熒光發(fā)射進行NIR-II生物成像具有較高的時間和空間分辨率，具有長期監(jiān)測能力,，可作為各種內(nèi)部生物過程成像的強大平臺,。

研究內(nèi)容：

圖1

2,、iRFP713的NIR-II體內(nèi)成像

本文采用基于CRISPR/ Cas9的基因組編輯技術(shù)將iRFP713基因敲入小鼠內(nèi)源性Rosa26位點(iRFP713flox/flox),。具體來說，是將一個lox-stop-lox (LSL)元件放置在iRFP713前面,，跟隨CAG啟動子,，防止iRFP713的表達，除非引入Cre重組酶去除停止盒,?；蚍中头治鲎C實成功構(gòu)建了所需的轉(zhuǎn)基因小鼠。在與不同組織特異性Cre系的iRFP713flox/flox小鼠雜交后,，通過Cre介導的重組,，位于兩個lox位點兩側(cè)的停止元件可以被刪除或倒置，導致iRFP713僅在表達Cre的組織中被激活,。因此,，使用該技術(shù)，本文建立一個組織特異性表達irfp713的轉(zhuǎn)基因小鼠(圖2a),。為了評估其成像能力,，本文生成了一個全身表達iRFP713的小鼠(iRFP713flox/flox;Ella-Cre)通過將iRFP713flox/flox鼠標與EIIa-Cre系雜交。在確認對小鼠沒有明顯的副作用或健康問題后,，我們檢查了所需后代的熒光特性,。與對照組(iRFP713flox/flox)相比，iRFP713flox/flox,；EIIa-Cre小鼠的整個身體表現(xiàn)出明亮的NIR-II熒光（圖2b）,。進一步檢測了表達iRFP713的小鼠在出生后1、3和8周甚至15個月的熒光,。結(jié)果表明,，通過NIR-II成像，可以在所有這些時間點清楚地檢測到iRFP713熒光信號（圖2bc）,。此外,，我們能夠區(qū)分某些器官的邊界,，例如肝臟，并從不同角度觀察內(nèi)部組織的細節(jié)（圖2c）,。此外,，我們對離體器官進行了體外NIR-II熒光成像（圖2d）。不同器官的熒光強度各不相同,，從腎臟和胃的熒光強度zui低,，心臟、肺和胰腺的熒光強度較高,，肝臟中熒光強度zui高（圖2de）,。這些數(shù)據(jù)共同表明，基于iRFP713的NIR-II熒光成像可以作為wu創(chuàng)組織觀察的平臺,。

圖2

3,、體內(nèi)肝臟再生實時追蹤

為了測試我們的成像系統(tǒng)是否具有長期觀察活體生物過程的潛力，我們使用肝臟再生作為監(jiān)測模型,。為了防止肝臟以外的非靶組織對iRFP713熒光的干擾,，比如在表達iRFP713的全身小鼠中，我們認為開發(fā)一種表達iRFP713的肝細胞特異性動物更合適,。為此,，我們將iRFP713flox/flox小鼠與Alb-Cre系雜交,，其中Cre重組酶受Alb啟動子控制,，使Cre只在肝細胞中表達(圖3a)。與預期的一樣,，幼(8周)和大(15個月)的iRFP713flox/flox; Alb-Cre小鼠的肝臟都可以通過NIR-II熒光清晰可見,，而對照組沒有顯示任何熒光（圖3b）。接下來,，我們在iRFP713flox/flox;Alb-Cre小鼠中建立了部分肝切除術(shù)(PHX)模型以監(jiān)測肝臟再生過程,。在該模型中，大約三分之二的肝臟被手術(shù)切除,，然后肝臟在7 - 10天內(nèi)通過肝細胞的增殖恢復到原來的質(zhì)量(圖3c),。如圖3d所示，當從右側(cè)觀察時,，NIR-II熒光成像能夠清楚地分辨PHX小鼠中包含三個部分（中葉,，左葉和右葉）的正常“冠狀"形狀,，并能看到切除中葉和左葉后殘余肝臟,。熒光的面積和強度從第1天到第7天逐漸增加，肝臟相應恢復和再生,。為了提供參考標準,，我們還通過造影劑增強μCT定量測量了殘余肝體積,，這在臨床環(huán)境中通常用于肝臟診斷μCT分析顯示，切除術(shù)后肝容量顯著增加,，第5天和第7天分別為191.0%±35.0%和218.3%±53.8%（圖3d）,。然后，我們估計了μCT肝臟測量數(shù)據(jù)與iRFP713輔助NIR-II熒光成像的相關(guān)性,。iRFP713熒光面積數(shù)據(jù)與μCT測量的體積（R2= 0.9595,，p< 0.01）（圖3d），表明我們的系統(tǒng)在小鼠肝臟可視化方面可與經(jīng)典的μCT相媲美,。吲哚菁綠（ICG）是一種臨床批準的安全熒光染料,，用于肝臟研究和近紅外熒光成像。為了比較iRFP713和這種染料的性能,，我們在PHX模型中使用ICG進行了NIR-II成像,。與iRFP713不同，我們必須在每次觀察之前通過尾靜脈單獨給予ICG,。ICG輔助成像沒有提供清晰的肝臟與其他組織對比,，因為染料被迅速代謝并且無法特異性地積聚在肝臟中（圖3e）。我們還采用了經(jīng)典的化學肝損傷模型,，對乙酰氨基酚（APAP）驅(qū)動的肝臟再生,，評估iRFP713和ICG的可視化功能。iRFP713輔助成像顯示,，由于APAP誘導的肝細胞死亡,，肝臟熒光強度在第1天下降了62.8%（圖3f），但在第2天和第3天分別增加了17.4%和35.1%（圖3f）,。這種“先跌后升"的現(xiàn)象與急性肝損傷的病理過程一致,，急性肝損傷表現(xiàn)出明顯的損傷和消退階段。然而,，在基于ICG的成像中沒有觀察到顯著變化（圖3f）,。

圖3

4、胰腺的wu創(chuàng)長期可視化

胰腺作為位于深部的器官之一,，兼具內(nèi)分泌和外分泌功能,，與糖尿病和胰腺炎等常見疾病過程明顯相關(guān)。為了測試我們的系統(tǒng)如何在這種深層組織中工作,，我們將iRFP713flox/flox與Pdx1-Cre品系雜交,，生成胰腺特異性iRFP713表達的小鼠 (iRFP713flox/flox;Pdx1-Cre)（圖4a）。在NIR-II成像下,，無論小鼠是年輕（8周）還是老年（15個月）,，胰腺中的熒光清晰，而它們的對照組則缺乏任何明顯的NIR-II熒光信號（圖4b）。然后,，我們通過在剖腹手術(shù)期間在充滿液體的胰腺和分離的胰腺中檢測來自胰腺內(nèi)部的熒光信號,，在這只轉(zhuǎn)基因小鼠中確認了胰腺特異性iRFP713熒光(圖4c)。為了驗證病理條件下的胰腺成像能力,，我們首先使用鏈脲佐菌素（STZ）生成糖尿病模型,。在這里，iRFP713fiox/flox;Pdx1-Cre小鼠被施予多種低劑量的STZ以誘導胰腺β細胞衰竭和死亡,。然后,，我們在不同的時間點進行了NIR-II熒光成像。如圖4d所示,，胰腺的熒光信號在STZ注射后第1,、3、5和7天略有下降,，但差異無統(tǒng)計學意義（圖4d）,。我們認為這主要是因為整個胰腺中表達iRFP713的β細胞百分比低。為了應對這一挑戰(zhàn),，我們給小鼠施用蔚藍素以誘導急性胰腺炎（圖4e）,。在該模型中，胰腺腺泡細胞（主要的表達iRFP713的細胞）是天青素的靶標,。影像學結(jié)果顯示,，腹腔注射天青素1天后，iRFP713熒光顯著下降,，隨后隨著胰腺從急性胰腺炎中恢復,，熒光顯著升高（圖4f）。這些數(shù)據(jù)表明,，胰腺特異性iRFP713的NIR-II成像可用于監(jiān)測生理和病理條件下的胰腺,。

圖4

總結(jié)：通過使用蛋白質(zhì)iRFP713作為探針，我們開發(fā)了一種生物相容性和可再生體內(nèi)NIR-II監(jiān)測方法,，具有深度穿透性和高成像對比度。該平臺不僅適用于準備組織特異性表達時的單組織觀察,，而且還能夠?qū)崿F(xiàn)任何器官的長期可視化,。我們相信，該平臺可以作為長期監(jiān)測許多活體生物過程的有力工具,。

參考文獻

doi.org/10.1038/s41467-022-34274-w

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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機,，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照,、熒光壽命,、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜,，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng),，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司,，被評為上海市"科技創(chuàng)新行動計劃"科學儀器領(lǐng)域立項單位。

          恒光智影,，專注于近紅外二區(qū)成像技術(shù),。致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供*的,、一體化的成像解決方案,。自主研發(fā)近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS。

          與基于可見光波長的傳統(tǒng)成像技術(shù)相比,，我們的技術(shù)側(cè)重于X射線,、紫外、紅外,、短波紅外,、太赫茲范圍，可為腫瘤學,、神經(jīng)學,、心血管、藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果,，助力科技研發(fā),。

          同時，恒光智影還具備探針研發(fā)能力,，我們已經(jīng)成功研發(fā)了超過15種探針,，這些探針將廣泛地應用于眾多生物科技前沿領(lǐng)域的相關(guān)研究中。