本文要點(diǎn)：高空間分辨率,、低背景和深層組織穿透力使近紅外II（NIR-II）熒光成像成為體內(nèi)觀察和測(cè)量的最關(guān)鍵工具之一,。然而，合成NIR-II熒光團(tuán)相對(duì)較短的保留時(shí)間和潛在的毒性限制了其長(zhǎng)期應(yīng)用,。本文報(bào)告了紅外熒光蛋白（iRFP）作為體外和體內(nèi)NIR-II探針的使用,，允許長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)成像（長(zhǎng)達(dá)15個(gè)月）。作為一個(gè)代表性的例子,，將iRFP713敲入小鼠基因組以產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)基因模型,，允許探針在時(shí)間和/或空間表達(dá)控制。為了證明其在真正的診斷環(huán)境中的可行性,，采用了兩種肝臟再生模型,，并成功跟蹤了一周的過(guò)程。性能和監(jiān)測(cè)效果與μCT相當(dāng),，優(yōu)于吲哚菁綠染料,。盡管胰腺的位置很深，但也能有效地觀察到生理和病理?xiàng)l件下的胰腺,。這些結(jié)果表明,，iRFP輔助的NIR-II熒光系統(tǒng)適用于監(jiān)測(cè)各種組織和體內(nèi)生物過(guò)程，提供了一個(gè)強(qiáng)大的wu創(chuàng)長(zhǎng)期成像平臺(tái),。

背景：熒光成像是在活體結(jié)構(gòu)和功能研究中應(yīng)用zui廣泛的技術(shù)之一,。使用第二近紅外區(qū)域(NIR-II, 900-1880nm)成像能夠以令人印象深刻的清晰度直接可視化和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)深層生物結(jié)構(gòu)和過(guò)程。迄今為止,，稀土摻雜納米顆粒(RENPs),，量子點(diǎn)(QDs)和某些有機(jī)熒光染料已被開(kāi)發(fā)用于多功能生物醫(yī)學(xué)成像中的NIR-II熒光探針。然而,，由于它們是化學(xué)合成的,，這些探針受到嚴(yán)重的限制，包括它們?cè)谏到y(tǒng)中bu可再生,，并可能存在潛在的生物毒性風(fēng)險(xiǎn),。在細(xì)胞分裂過(guò)程中,，這種探針在兩個(gè)子細(xì)胞之間的分割將導(dǎo)致信號(hào)衰減，導(dǎo)致在多次細(xì)胞復(fù)制后探針不再被檢測(cè)到,。此外,，合成探針可以通過(guò)體內(nèi)的生物過(guò)程快速分解或消除，根據(jù)類(lèi)型,，外源性熒光探針可能表現(xiàn)出一定程度的細(xì)胞毒性,。因此，這些探頭不適用于長(zhǎng)時(shí)間成像,。作為一種替代且更具生物相容性的選擇,，熒光蛋白（FPs）在長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)中比化學(xué)合成探針具有很大的優(yōu)勢(shì)。已報(bào)道了多條近紅外FP線,。其中,，紅外熒光蛋白（iRFP）系列，包括iRFP670,、iRFP682,、iRFP702、iRFP713和iRFP720,，在近紅外波長(zhǎng)下具有發(fā)射和激發(fā)光譜,。iRFP是杜鵑假單胞菌細(xì)菌植物色素的工程版本，可實(shí)現(xiàn)wu創(chuàng)和長(zhǎng)期體內(nèi)可視化,。然而,，到目前為止，只有NIR-I區(qū)域被開(kāi)發(fā),。為了探索iRFP在NIR-II區(qū)域的應(yīng)用，本文研究證明了iRFP713通過(guò)非峰值熒光發(fā)射進(jìn)行NIR-II生物成像具有較高的時(shí)間和空間分辨率,，具有長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)能力,，可作為各種內(nèi)部生物過(guò)程成像的強(qiáng)大平臺(tái)。

研究?jī)?nèi)容：

圖1

2,、iRFP713的NIR-II體內(nèi)成像

本文采用基于CRISPR/ Cas9的基因組編輯技術(shù)將iRFP713基因敲入小鼠內(nèi)源性Rosa26位點(diǎn)(iRFP713flox/flox)。具體來(lái)說(shuō),，是將一個(gè)lox-stop-lox (LSL)元件放置在iRFP713前面,，跟隨CAG啟動(dòng)子，防止iRFP713的表達(dá),，除非引入Cre重組酶去除停止盒,。基因分型分析證實(shí)成功構(gòu)建了所需的轉(zhuǎn)基因小鼠,。在與不同組織特異性Cre系的iRFP713flox/flox小鼠雜交后,，通過(guò)Cre介導(dǎo)的重組，位于兩個(gè)lox位點(diǎn)兩側(cè)的停止元件可以被刪除或倒置,，導(dǎo)致iRFP713僅在表達(dá)Cre的組織中被激活,。因此，使用該技術(shù),，本文建立一個(gè)組織特異性表達(dá)irfp713的轉(zhuǎn)基因小鼠(圖2a),。為了評(píng)估其成像能力，本文生成了一個(gè)全身表達(dá)iRFP713的小鼠(iRFP713flox/flox;Ella-Cre)通過(guò)將iRFP713flox/flox鼠標(biāo)與EIIa-Cre系雜交,。在確認(rèn)對(duì)小鼠沒(méi)有明顯的副作用或健康問(wèn)題后,，我們檢查了所需后代的熒光特性。與對(duì)照組(iRFP713flox/flox)相比,，iRFP713flox/flox,；EIIa-Cre小鼠的整個(gè)身體表現(xiàn)出明亮的NIR-II熒光（圖2b）。進(jìn)一步檢測(cè)了表達(dá)iRFP713的小鼠在出生后1,、3和8周甚至15個(gè)月的熒光,。結(jié)果表明，通過(guò)NIR-II成像，可以在所有這些時(shí)間點(diǎn)清楚地檢測(cè)到iRFP713熒光信號(hào)（圖2bc）,。此外,，我們能夠區(qū)分某些器官的邊界，例如肝臟,，并從不同角度觀察內(nèi)部組織的細(xì)節(jié)（圖2c）,。此外，我們對(duì)離體器官進(jìn)行了體外NIR-II熒光成像（圖2d）,。不同器官的熒光強(qiáng)度各不相同,，從腎臟和胃的熒光強(qiáng)度zui低，心臟,、肺和胰腺的熒光強(qiáng)度較高，肝臟中熒光強(qiáng)度zui高（圖2de）,。這些數(shù)據(jù)共同表明,，基于iRFP713的NIR-II熒光成像可以作為wu創(chuàng)組織觀察的平臺(tái)。

圖2

3,、體內(nèi)肝臟再生實(shí)時(shí)追蹤

為了測(cè)試我們的成像系統(tǒng)是否具有長(zhǎng)期觀察活體生物過(guò)程的潛力,，我們使用肝臟再生作為監(jiān)測(cè)模型。為了防止肝臟以外的非靶組織對(duì)iRFP713熒光的干擾,，比如在表達(dá)iRFP713的全身小鼠中,，我們認(rèn)為開(kāi)發(fā)一種表達(dá)iRFP713的肝細(xì)胞特異性動(dòng)物更合適。為此,，我們將iRFP713flox/flox小鼠與Alb-Cre系雜交,，其中Cre重組酶受Alb啟動(dòng)子控制，使Cre只在肝細(xì)胞中表達(dá)(圖3a),。與預(yù)期的一樣,，幼(8周)和大(15個(gè)月)的iRFP713flox/flox; Alb-Cre小鼠的肝臟都可以通過(guò)NIR-II熒光清晰可見(jiàn)，而對(duì)照組沒(méi)有顯示任何熒光（圖3b）,。接下來(lái),，我們?cè)趇RFP713flox/flox;Alb-Cre小鼠中建立了部分肝切除術(shù)(PHX)模型以監(jiān)測(cè)肝臟再生過(guò)程。在該模型中,，大約三分之二的肝臟被手術(shù)切除,，然后肝臟在7 - 10天內(nèi)通過(guò)肝細(xì)胞的增殖恢復(fù)到原來(lái)的質(zhì)量(圖3c),。如圖3d所示,，當(dāng)從右側(cè)觀察時(shí)，NIR-II熒光成像能夠清楚地分辨PHX小鼠中包含三個(gè)部分（中葉,，左葉和右葉）的正?！肮跔?形狀，并能看到切除中葉和左葉后殘余肝臟。熒光的面積和強(qiáng)度從第1天到第7天逐漸增加,，肝臟相應(yīng)恢復(fù)和再生,。為了提供參考標(biāo)準(zhǔn)，我們還通過(guò)造影劑增強(qiáng)μCT定量測(cè)量了殘余肝體積,，這在臨床環(huán)境中通常用于肝臟診斷μCT分析顯示,，切除術(shù)后肝容量顯著增加，第5天和第7天分別為191.0%±35.0%和218.3%±53.8%（圖3d）,。然后,，我們估計(jì)了μCT肝臟測(cè)量數(shù)據(jù)與iRFP713輔助NIR-II熒光成像的相關(guān)性。iRFP713熒光面積數(shù)據(jù)與μCT測(cè)量的體積（R2= 0.9595,，p< 0.01）（圖3d）,，表明我們的系統(tǒng)在小鼠肝臟可視化方面可與經(jīng)典的μCT相媲美。吲哚菁綠（ICG）是一種臨床批準(zhǔn)的安全熒光染料,，用于肝臟研究和近紅外熒光成像,。為了比較iRFP713和這種染料的性能，我們?cè)赑HX模型中使用ICG進(jìn)行了NIR-II成像,。與iRFP713不同,，我們必須在每次觀察之前通過(guò)尾靜脈單獨(dú)給予ICG。ICG輔助成像沒(méi)有提供清晰的肝臟與其他組織對(duì)比,，因?yàn)槿玖媳谎杆俅x并且無(wú)法特異性地積聚在肝臟中（圖3e）,。我們還采用了經(jīng)典的化學(xué)肝損傷模型，對(duì)乙酰氨基酚（APAP）驅(qū)動(dòng)的肝臟再生,，評(píng)估iRFP713和ICG的可視化功能,。iRFP713輔助成像顯示，由于APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡,，肝臟熒光強(qiáng)度在第1天下降了62.8%（圖3f）,，但在第2天和第3天分別增加了17.4%和35.1%（圖3f）。這種“先跌后升"的現(xiàn)象與急性肝損傷的病理過(guò)程一致,，急性肝損傷表現(xiàn)出明顯的損傷和消退階段,。然而，在基于ICG的成像中沒(méi)有觀察到顯著變化（圖3f）,。

圖3

4,、胰腺的wu創(chuàng)長(zhǎng)期可視化

胰腺作為位于深部的器官之一，兼具內(nèi)分泌和外分泌功能,，與糖尿病和胰腺炎等常見(jiàn)疾病過(guò)程明顯相關(guān),。為了測(cè)試我們的系統(tǒng)如何在這種深層組織中工作，我們將iRFP713flox/flox與Pdx1-Cre品系雜交,，生成胰腺特異性iRFP713表達(dá)的小鼠 (iRFP713flox/flox;Pdx1-Cre)（圖4a）,。在NIR-II成像下，無(wú)論小鼠是年輕（8周）還是老年（15個(gè)月），胰腺中的熒光清晰,，而它們的對(duì)照組則缺乏任何明顯的NIR-II熒光信號(hào)（圖4b）,。然后，我們通過(guò)在剖腹手術(shù)期間在充滿液體的胰腺和分離的胰腺中檢測(cè)來(lái)自胰腺內(nèi)部的熒光信號(hào),，在這只轉(zhuǎn)基因小鼠中確認(rèn)了胰腺特異性iRFP713熒光(圖4c),。為了驗(yàn)證病理?xiàng)l件下的胰腺成像能力，我們首先使用鏈脲佐菌素（STZ）生成糖尿病模型,。在這里,，iRFP713fiox/flox;Pdx1-Cre小鼠被施予多種低劑量的STZ以誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞衰竭和死亡。然后,，我們?cè)诓煌臅r(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了NIR-II熒光成像,。如圖4d所示，胰腺的熒光信號(hào)在STZ注射后第1,、3,、5和7天略有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4d）,。我們認(rèn)為這主要是因?yàn)檎麄€(gè)胰腺中表達(dá)iRFP713的β細(xì)胞百分比低,。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，我們給小鼠施用蔚藍(lán)素以誘導(dǎo)急性胰腺炎（圖4e）,。在該模型中,，胰腺腺泡細(xì)胞（主要的表達(dá)iRFP713的細(xì)胞）是天青素的靶標(biāo)。影像學(xué)結(jié)果顯示,，腹腔注射天青素1天后,，iRFP713熒光顯著下降，隨后隨著胰腺?gòu)募毙砸认傺字谢謴?fù),，熒光顯著升高（圖4f）,。這些數(shù)據(jù)表明，胰腺特異性iRFP713的NIR-II成像可用于監(jiān)測(cè)生理和病理?xiàng)l件下的胰腺,。

圖4

總結(jié)：通過(guò)使用蛋白質(zhì)iRFP713作為探針,，我們開(kāi)發(fā)了一種生物相容性和可再生體內(nèi)NIR-II監(jiān)測(cè)方法，具有深度穿透性和高成像對(duì)比度,。該平臺(tái)不僅適用于準(zhǔn)備組織特異性表達(dá)時(shí)的單組織觀察,，而且還能夠?qū)崿F(xiàn)任何器官的長(zhǎng)期可視化。我們相信,，該平臺(tái)可以作為長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)許多活體生物過(guò)程的有力工具,。

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1038/s41467-022-34274-w

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近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭,，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

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多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照,、熒光壽命、一區(qū)熒光成像,、原位成像光譜,，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司,，被評(píng)為上海市"科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃"科學(xué)儀器領(lǐng)域立項(xiàng)單位,。

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          與基于可見(jiàn)光波長(zhǎng)的傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，我們的技術(shù)側(cè)重于X射線,、紫外,、紅外、短波紅外,、太赫茲范圍,，可為腫瘤學(xué)、神經(jīng)學(xué),、心血管,、藥代動(dòng)力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，助力科技研發(fā),。

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