4-香豆酸：輔酶A連接酶（4CL）活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）產(chǎn)品貨號：BA1005

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介

4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶之一,，主要催化肉桂酸及其羥基或者甲氧基衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酯,，這些中間產(chǎn)物隨后進(jìn)入苯丙類衍生物支路合成途徑。該酶主要存在于高等植物,、酵母和菌類中,，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù),。

4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA,，其在333nm下測有特征吸收峰，測定4-香豆酸CoA的生成速率,，即可反應(yīng)4CL活性,。

產(chǎn)品內(nèi)容： 

溶液的配制：

1. 提取液：內(nèi)含不溶物，使用前搖勻,；

2. 試劑二：臨用前加入6mL蒸餾水溶解,，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融,；

3. 試劑四：臨用前用6mL蒸餾水溶解備用,，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融,；

4. 試劑五：加入1mL蒸餾水溶解,，臨用前用蒸餾水稀釋40倍后備用，現(xiàn)用現(xiàn)配,；

5. 工作液的配制：按體積比將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=1:1:1:1的比例配制工作液,，現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī),、水浴鍋,、1mL石英比色皿,、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,。

操作步驟（僅供參考）：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率20%或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

2. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

二,、測定步驟

1. 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至333nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 操作表（在1.5mL EP管中進(jìn)行下列操作）：

三,、4CL活計(jì)算 

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位,。

4CL（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹ ]÷(V樣×Cpr) ÷T

=15.87×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算：

單位定義：每g組織每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。

4CL（U/g質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹ ]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

=15.87×ΔA÷W

3. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位,。

4CL（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹ ]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.03174×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，1×10^-3 L；ε：4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù),，2.1×10⁴ L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.1mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，30min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬；10⁹：單位換算系數(shù),，1mol=10⁹nmol,。

注意事項(xiàng)：

1. 若ΔA大于0.5，將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定,。

2. 建議一次測定不要測定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時間。

3. 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔,，正常情況下,，變化不超過0.01。