4-香豆酸：輔酶A連接酶（4CL）活性檢測試劑盒（微量法）

產品貨號：BA1006

產品規(guī)格：100管/96樣

產品簡介

4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate:CoA ligase,，4CL）是木質素生物合成的關鍵酶之一，主要催化肉桂酸及其羥基或者甲氧基衍生物生成相應的輔酶A酯,，這些中間產物隨后進入苯丙類衍生物支路合成途徑,。該酶主要存在于高等植物,、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質素沉積的代謝機理,，為減少水果石細胞含量而提高其品質提供依據,。

4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm下測有特征吸收峰,，測定4-香豆酸CoA的生成速率,，即可反應4CL活性。

產品內容： 

溶液的配制：

1. 提取液：內含不溶物,，使用前搖勻,；

2. 試劑二：臨用前加入3mL蒸餾水溶解，可以分裝后-20℃保存,，避免反復凍融,；

3. 試劑四：臨用前用4mL蒸餾水溶解備用，可以分裝后-20℃保存,，避免反復凍融,；

4. 試劑五：加入1mL蒸餾水溶解，臨用前用蒸餾水稀釋40倍后備用,，現用現配,；

5. 工作液的配制：按體積比將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=1:1:1:1的比例配制工作液，現用現配,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計,、低溫離心機,、水浴鍋、1mL石英比色皿,、可調式移液槍,、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水,。

操作步驟（僅供參考）：

一,、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內,，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率20%或200W,，超聲3s，間隔10s,，重復30次）,；8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

2. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上,，調節(jié)波長至333nm,，蒸餾水調零。

2. 操作表（在0.5mL EP管中進行下列操作）：

三、4CL活計算 

A,、按微量石英比色皿計算： 

1. 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位,。

4CL（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹ ]÷(V樣×Cpr) ÷T

=15.87×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質量計算：

單位定義：每g組織每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。

4CL（U/g質量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹ ]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

=15.87×ΔA÷W

3. 按細菌或細胞數量計算：

單位定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位,。

4CL（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹ ]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.03174×ΔA

V反總：反應體系總體積,，2×10^-4 L；ε：4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數,，2.1×10⁴ L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.02mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；T：反應時間，30min；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,；W：樣本質量，g,；500：細菌或細胞總數,，500萬；10⁹：單位換算系數,，1mol=10⁹nmol,。

B、按96孔UV板計算： 

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進行計算即可,。

注意事項：

1. 若ΔA大于0.5,，將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定。

2. 建議一次測定不要測定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應時間,。

3. 空白管為檢測各試劑組分質量的檢測孔,，正常情況下，變化不超過0.01,。