細胞培養(yǎng)常見問題及其解決辦法

1. 如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件,。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長,?？傊?/span>MEM做粘附細胞培養(yǎng),、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始,。

2. 何時須更換培養(yǎng)基,？

視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,，按時更換培養(yǎng)基即可,。

3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能,。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基,，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應,， 造成細胞無法存活,。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？

不能,。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,，在一些物質或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,， 兩者都是指胎牛血清,， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用,。CS (calf serum) 則是指小牛血清,。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2,？或根本沒有影響,？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度,。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,，細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時,， 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞,。

7.Hank's 蛋白酶(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱,。原因是什么,？Hank's 蛋白酶(HBS)和Earle's蛋白酶(EBS)有什么本質的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高,。氫鈉需用高水平的CO2平衡,，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿,，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸,。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液,，,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了,。

8. 細胞之接種密度為何,？

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因,。

9. 懸浮性細胞應如何繼代處理,？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細胞濃度即可,，若培養(yǎng)液太多時,， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止,。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可,。

10.冷凍管應如何解凍,？

取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍,， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化,， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形,。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂,。

11. 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,， 是否應馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外,， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）,， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度,？應如何處理,？

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,，保存于–20 °C,，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低，并可減少污染之機會,。

13.欲將一般動物細胞離心下來,，其離心速率應為多少轉速？

欲回收動物細胞,， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),，5 - 10 分鐘， 過高之轉速,， 將造成細胞死亡,。

14. 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之,。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,，故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成,。

15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何,？

冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),，其本身即為無菌狀況,， 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C,，避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質,， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO,， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜,。

16.冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存,。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下,， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時,，以防止冰晶過大,，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,，惟存活率稍微 降低一些,。

17. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度,？

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial,， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜,。

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外,， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,， 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。

19.應如何避免細胞污染,？

細胞污染的種類可分成細菌,、酵母菌、霉菌,、病毒和霉?jié){菌,。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳,、污染之血清和污染之細胞等,。嚴格之無菌操作技術、清潔的環(huán)境,、與品質良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染好方法,。

20.如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理,？

原則上：直接滅菌后丟棄之,。

當重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染,。首先,，確定污染物是細菌、真菌,、支原體或酵母,，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,，檢查HEPA過濾器,。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而,，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平,。這點在使用抗生素如霉素b和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟,。

1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化,、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度,。

2.分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi),，把選擇抗生素加入到每一個孔中,。例如,，霉素b推薦下列濃度，0.25,，0.50,，1.0，2.0,，4.0,8.0 mg/ml。

3.每天觀測細胞毒性指標,，如脫落,，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓,。

4.確定抗生素毒性水平后,，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3代。

5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代,。

6.重復步驟4,。

7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除,。

21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞,，是否能以肉眼觀察出異狀？

不能,。除極有經(jīng)驗之專家外,，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之,。

22.支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響,？

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù),。故進行實驗前,，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義,。

23. 偵測出細胞株有支原體污染時,， 該如何處理？

直接滅菌后丟棄,，以避免污染其它細胞株,。

24. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之,。

25.為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性,？

培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅,。培養(yǎng)基偏堿之結果,，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時,，可以通入無菌過濾之CO2,， 以調(diào)整pH 值。

26. 各種細胞培養(yǎng)用的dish,，flask是否均相同,？

不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同,， 制造程序亦不同,， 雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異,。

27. 購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后,，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？

研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少,， 大都是因為離心過程操作上的失誤,，造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失,。建議細胞解凍后不要立刻離心,， 應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

28.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因,？

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳,， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳,。解凍過程錯誤,。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心,。懸浮細胞誤認為死細胞,。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久,。

29. 收到之冷凍管瓶身破裂,，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因,？

冷凍管瓶蓋裂紋,，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,，造成冷凍管裂損,，建議使用止血鉗小心夾取,。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象,，冷凍管有可能因此而造成細胞污染,，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊,。

30.L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎,？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的,。脫掉氨基后,，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝,。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論,。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,，而氨對于一些細胞具有毒性。

31.GlutaMAX-I是什么,？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I,？這個二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護,。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用,。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,，如果在相同條件下,，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

32.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅,？

酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色,，酸性時為黃色，堿性時為紫色,。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）,。為避免固醇類反應,，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時,，用不加酚紅的培養(yǎng)基,。由于酚紅干擾檢測,，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基,。

33.如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞,？

用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺盼蘭溶液,。輕輕混勻,，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞,?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色細胞是死細胞,。

34.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么,？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,，但是,，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉,。

35.二價離子抑制蛋白酶活性嗎,？使用蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離子的確抑制蛋白酶活性,。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,，以便保持抑制蛋白酶的活性。建議蛋白酶處理細胞前,，用EDTA清洗細胞,，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

36.室溫下配制的Tris-HCl溶液,，在37℃使用時PH值是多少,？

緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,，25℃,，37℃時，不同PH值,。 

37.如何從T25瓶中轉移sf9細胞,？能用蛋白酶消化嗎？

我們推薦使用脫落細胞的方法,，此技術破壞性最小,，生活力最高。通過使用巴斯德吸液管，讓細胞上培養(yǎng)基流動,。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶,。只有在絕對必要的情況下，才使用胰消化細胞,。

38.胰消化一個T25瓶的sf9細胞：

1. 去除培養(yǎng)基,。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS,。

3. 加入2ml 1x胰EDTA（恰好覆蓋細胞表面）,。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動,。

5. 向細胞中加入2ml 細胞培養(yǎng)液,，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁,，移入同一錐形管中,。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰的活性。）

6. 離心（1100rpm）沉淀細胞,。去除培養(yǎng)基,。

7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。傳代,。

39.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養(yǎng)時,，肝素的使用量是多少,？

為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成,，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

40.在重新凍存sf9細胞前,，它可以傳多少代,？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎,？

通常情況當細胞經(jīng)過30次傳代后,，應該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時,，都應該檢查細胞活力,。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用,。如果活力和加倍時間下降,，它們的感染力將不在是有效的。

41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基,，在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時,，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘,，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）,。

42. 細胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用,？

如果細胞培養(yǎng)基偶然被凍,，您應該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生,，培養(yǎng)基可以正常使用,，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基,。

43. 無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎,？

當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%,。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素,。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活,，可能對于細胞達到毒性水平,。

44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎,？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時,，您應該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解,。

45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎,？

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,，將會影響它的性能,。