細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及其解決辦法

1. 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基,？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞,，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng),?？傊?，MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始,。

2. 何時(shí)須更換培養(yǎng)基,？

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可,。

3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基,，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無法存活,。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類,？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源,，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響,。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活,。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清,， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼,， 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清,。HS (horseserum) 則是指馬血清,。

6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響,？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí),，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2,；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞,。

7.Hank's 蛋白酶(HBS)要在空氣中使用,，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么,？Hank's 蛋白酶(HBS)和Earle's蛋白酶(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別,？

HBS和 EBS 的主要差別在于氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。氫鈉需用高水平的CO2平衡,，以維持溶液的PH值,。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿,，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸,。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,，需要用Eagles液，,。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,，用Hanks液就可以了。

8. 細(xì)胞之接種密度為何,？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可,。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長(zhǎng)之一重要原因。

9. 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理,？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,， 稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí),， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,， 直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度,， 重復(fù)前述步驟即可。

10.冷凍管應(yīng)如何解凍,？

取出冷凍管后,， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化,， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),， 必須注意安全,， 預(yù)防冷凍管之爆裂。

11. 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),， 是否應(yīng)馬上去除DMSO,？

除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）,， 在解凍之后,， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長(zhǎng)或貼附之問題,。

12. 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理,？

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na,。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 °C,，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,，并可減少污染之機(jī)會(huì)。

13.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來,，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速,？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),，5 - 10 分鐘,， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡,。

14. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何,？

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中,， 必須使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等級(jí)和無菌過濾之方式為何,？

冷凍保存使用之DMSO 等級(jí),， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況,， 第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,， 保存于4°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì),， 并可減少污染之機(jī)會(huì),。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜,。

16.冷凍保存細(xì)胞之方法,？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下,， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。*-20 °C 不可超過1 小時(shí)，以防止冰晶過大,，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些,。

17. 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí),， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial,， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜,。

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外,， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素,。

19.應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌,、酵母菌,、霉菌、病毒和霉?jié){菌,。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng),、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等,。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù),、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染好方法,。

20.如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí),，應(yīng)如何處理？

原則上：直接滅菌后丟棄之,。

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí),，研究者可能試圖消除或控制污染。首先,，確定污染物是細(xì)菌,、真菌、支原體或酵母,，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開,，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過濾器,。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平,。這點(diǎn)在使用抗生素如霉素b和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要,。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。

1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化,、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞,，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

2.分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中,。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中,。例如,，霉素b推薦下列濃度，0.25,，0.50,，1.0,，2.0，4.0,8.0 mg/ml,。

3.每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),，如脫落，出現(xiàn)空泡,，匯合度下降和變圓,。

4.確定抗生素毒性水平后,，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代,。

5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

6.重復(fù)步驟4,。

7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代,，確定污染是否以已被消除。

21.支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞,，是否能以肉眼觀察出異狀,？

不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外,，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,，無法以其外觀分辨之。

22.支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響,？

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù),， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

23. 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí),， 該如何處理,？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株,。

24. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔,？

定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

25.為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 顏色會(huì)偏暗紅色,， 且pH值會(huì)越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅,。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果,，將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡,。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾之CO2,， 以調(diào)整pH 值,。

26. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同,？

不同廠牌的dish 或flask,， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同,， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響,，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。

27. 購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形,？

研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤,，造成細(xì)胞的物理性損傷,， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,， 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可,。

28.購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤,。冷凍細(xì)胞解凍后,，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞,。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤,。細(xì)胞置于–80 °C 太久。

29. 收到之冷凍管瓶身破裂,，瓶蓋有裂紋,，或瓶蓋脫落之原因？

冷凍管瓶蓋裂紋,，或瓶身破裂,，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損,，建議使用止血鉗小心夾取,。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染,，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

30.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎,？它在溶液中不穩(wěn)定嗎,？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源,、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,，但是確切的降解率一直沒有最終定論,。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性,。

31.GlutaMAX-I是什么,？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I,？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定,？

GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù),。一種肽酶逐漸裂解二肽,，釋放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,，即使在121磅滅菌20分鐘,，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下,，L-谷氨酰胺幾乎*降解,。

32.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色,，酸性時(shí)為黃色,，堿性時(shí)為紫色。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用,，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng),，培養(yǎng)細(xì)胞,，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基,。由于酚紅干擾檢測(cè),，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

33.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞,？

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個(gè)/毫升,，在0.1毫升細(xì)胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻,，數(shù)分鐘后,，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭,，因而染成藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞。

34.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么,？

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是,，如果沒有葡萄糖的話,，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

35.二價(jià)離子抑制蛋白酶活性嗎,？使用蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么,？

二價(jià)離子的確抑制蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,，以便保持抑制蛋白酶的活性,。建議蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞,，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子,。

36.室溫下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少,？

緩沖液PH值隨溫度變化而變化,。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃,，37℃時(shí),，不同PH值。 

37.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞,？能用蛋白酶消化嗎,？

我們推薦使用脫落細(xì)胞的方法，此技術(shù)破壞性最小,，生活力最高,。通過使用巴斯德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng),。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶,。只有在絕對(duì)必要的情況下，才使用胰消化細(xì)胞。

38.胰消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞：

1. 去除培養(yǎng)基,。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞,，去除PBS。

3. 加入2ml 1x胰EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）,。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘,。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。

5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液,，移入錐形管,，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中,。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰的活性,。）

6. 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基,。

7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞,。傳代。

39.在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí),，肝素的使用量是多少,？

為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液,。

40.在重新凍存sf9細(xì)胞前,，它可以傳多少代,？隨著傳代的次數(shù)的增加,，它的感染能力會(huì)降低嗎？

通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后,，應(yīng)該返回凍存,。無論什么時(shí)候計(jì)數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力,。如果超過95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍,，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降,，它們的感染力將不在是有效的,。

41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時(shí),，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升,。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘,，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）,。

42. 細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？

如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,，您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生,。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用,，如果出現(xiàn)沉淀,，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

43. 無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎,？

當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí),，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素,。在無血清培養(yǎng)條件下,，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平,。

44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,，可長(zhǎng)期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它,。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。

45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎,？

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能,。