外泌體是由細(xì)胞分泌的納米級膜性小囊泡,，直徑約30~150nm。外泌體來源多樣,，廣泛存在并分布于各種生物液體中,，富含來源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸,，參與細(xì)胞間的信息交流,。不同病理和生理?xiàng)l件下,，外泌體的內(nèi)容物不盡相同，因此外泌體可以很好地反映生物體的疾病與健康狀態(tài),。此外,，外泌體特殊的膜結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)其內(nèi)容物如RNA（microRNA、mRNA,、lncRNA,、circRNA）免受酶的降解，保證其能在各類體液中被穩(wěn)定檢測到,，因此外泌體是研究各種疾病的良好生物學(xué)材料,，可作為腫瘤潛在的biomarker和治療靶點(diǎn)，亦可作為基因/藥物的遞送載體,，在疾病的診斷和治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景,。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年國自然中標(biāo)的外泌體相關(guān)項(xiàng)目總計(jì)600多項(xiàng),，總金額高達(dá)2.5億,，相較2018年，總金額增長了44.5%,，足可見外泌體研究的火熱程度,。近幾年，隨著高通量檢測技術(shù)的飛速發(fā)展,，對外泌體進(jìn)行組學(xué)研究極大地推動了外泌體的研究進(jìn)展,。伯豪生物致力于科研服務(wù)，擁有高標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理平臺,、微陣列芯片平臺,、高通量測序平臺、生物標(biāo)志物平臺,、生物信息分析平臺等多個平臺,，能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體分離、鑒定,、內(nèi)含物（蛋白質(zhì),、mRNA、ncRNA）檢測及驗(yàn)證的“一站式”外泌體研究服務(wù),。

那么如何開展外泌體研究,，第一步也是相當(dāng)重要的一步就是收集外泌體含量高的樣本。外泌體存在于各種生物體液中,，如血液,、乳汁、尿液，腦脊液,，那么如何有效的收集各種類型的樣本用于后續(xù)的外泌體分離呢,，下面我們來簡單介紹下各類型外泌體樣本的具體收集方法。

注意：收集血清樣本時一定不能加入抗凝劑,。

1) 采集外周血（建議早晨空腹抽血）,，迅速轉(zhuǎn)入不含EDTA的試管中,；

2) 室溫（22℃~25℃）下靜置30分鐘,，或4℃下靜置3~4小時，可見自行凝固,；

3) 吸取上清至新的離心管中,，4℃，8200×g離心10分鐘,；

4) 吸取上清至新的離心管中,，4℃，16000×g離心10分鐘,；

5) 小心吸取上清至新的離心管中（1.5ml離心管,，每管不超過1ml）， -80℃保存,；

6）干冰寄送樣本,。

提示：建議送樣量5 mL 以上（大致需全血8-10mL）

血漿

注意：收集血漿樣本用于RNA研究時一定不要用肝素抗凝管。

1) 采集外周血（建議早晨空腹抽血）,，迅速轉(zhuǎn)入EDTA抗凝管中,，渦旋或顛倒混合5～10 次；

2) 在1小時（室溫）或2小時（4℃）內(nèi)進(jìn)行血漿分離,，8200×g離心10分鐘,；

3) 吸取上清至新的離心管中，4℃,，16000×g離心10分鐘,；

4) 小心吸取上清至新的離心管中（1.5ml離心管，每管不超過1ml）,，-80℃保存,；

5）干冰寄送樣本。

提示：建議送樣量5 mL以上（大致需全血8-10mL）

Tips: 血液樣本外泌體研究血清好還是血漿好,？

血漿=血液-血細(xì)胞,；血清=血漿-纖維蛋白原-凝血因子；血清是血液凝固之后收集的液體,，在凝血過程中血小板會分泌大量的外泌體,，有研究發(fā)現(xiàn)血清中有接近50%的外泌體來自額外的分泌，所以一般實(shí)驗(yàn)會選擇血漿。在特殊情況下,，如研究與血小板相關(guān)疾病的時候,，血清比血漿更適合。此外,，在采血后最好盡快處理樣本,，因血液收集到收集管后，血細(xì)胞和血小板會繼續(xù)分泌外泌體

細(xì)胞上清

注意：細(xì)胞培養(yǎng)基必須使用去除外泌體的血清或者無血清培養(yǎng)基

1) 正常含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞24h左右,，貼壁細(xì)胞密度達(dá)到70%~80%,，懸浮細(xì)胞密度達(dá)到60%~70%；

2) 將原有血清培養(yǎng)基更換為去除外泌體的血清或者無血清培養(yǎng)基（貼壁細(xì)胞直接去除原有培養(yǎng)基,，加入適量PBS緩沖液沖洗一次,，更換新的培養(yǎng)基；懸浮細(xì)胞4℃,，300×g離心10分鐘,，收集細(xì)胞后，加入適量PBS緩沖液沖洗一次,，更換新的培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng),；

3) 培養(yǎng)48-72小時后，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量確定收取上清時間,；

4) 4℃,，300×g，離心10分鐘收集細(xì)胞上清,；

5) 4℃,，3000×g，離心15分鐘,，確保將細(xì)胞及細(xì)胞碎片去除干凈,；

6) 吸取上清，-80℃保存,；

7）干冰寄送樣本,。

提示：送樣量最好在50 mL 以上，不少于30ml

尿液

1) 收集清晨第一次尿液50ml,，注意避免細(xì)菌污染,，收集前注意飲食控制，前一晚22:00后禁食禁水,；

2) 4 ℃ ,，3000×g，離心15分鐘,，去除細(xì)胞或細(xì)胞碎片,；

3) 收集上清尿液分裝轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，-80℃保存；

4）干冰寄送樣本,。

提示：送樣量最好在50 mL 以上

腦脊液

1) 收集腦脊液,，收集過程中避免血液污染；

2) 3000×g,，離心15分鐘,，去除細(xì)胞或細(xì)胞碎片；

3) 收集上清,，-80℃冰箱中保存,；

4）干冰寄送樣本。

提示：送樣量最好在20 mL 以上

注：以上建議的送樣量綜合考慮了外泌體的表征檢測（TEM,、NTA,、WB）和組學(xué)研究（轉(zhuǎn)錄組,、蛋白質(zhì)組）的樣本需求量,。上述細(xì)胞上清送樣量主要指常規(guī)腫瘤細(xì)胞，對于其他類型細(xì)胞,，最好在送樣前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),，以確定外泌體含量。

目前外泌體的分離方法中應(yīng)用廣泛的是超速離心法和試劑盒抽提法,，超速離心法是外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn),，是高分文章常用的分離方法，獲得的外泌體純度高,。其原理主要是依據(jù)外泌體與其他微小囊泡密度和大小的不同而分離,，通過逐步提高離心速度，有效去除細(xì)胞,、細(xì)胞碎片和大囊泡,，收集高純度的外泌體。外泌體抽提試劑盒分離外泌體省時省力,，外泌體純度高,，SBI外泌體抽提試劑盒，樣本需求量少,，最少可從100ul血清或5ml細(xì)胞上清中分離外泌體,。利用超離或試劑盒法分離獲得的外泌體，經(jīng)表征檢測確定后即可進(jìn)行后續(xù)的組學(xué)研究,。

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