外泌體是由細胞分泌的納米級膜性小囊泡,，直徑約30~150nm,。外泌體來源多樣，廣泛存在并分布于各種生物液體中,，富含來源細胞的蛋白質(zhì),、脂質(zhì)和核酸，參與細胞間的信息交流,。不同病理和生理條件下,，外泌體的內(nèi)容物不盡相同,，因此外泌體可以很好地反映生物體的疾病與健康狀態(tài),。此外，外泌體特殊的膜結(jié)構(gòu)能夠保護其內(nèi)容物如RNA（microRNA,、mRNA,、lncRNA、circRNA）免受酶的降解,，保證其能在各類體液中被穩(wěn)定檢測到,，因此外泌體是研究各種疾病的良好生物學(xué)材料，可作為腫瘤潛在的biomarker和治療靶點,，亦可作為基因/藥物的遞送載體,，在疾病的診斷和治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

據(jù)統(tǒng)計,，2019年國自然中標的外泌體相關(guān)項目總計600多項,，總金額高達2.5億，相較2018年，總金額增長了44.5%,，足可見外泌體研究的火熱程度,。近幾年，隨著高通量檢測技術(shù)的飛速發(fā)展,，對外泌體進行組學(xué)研究極大地推動了外泌體的研究進展,。伯豪生物致力于科研服務(wù)，擁有高標準的樣品處理平臺,、微陣列芯片平臺,、高通量測序平臺、生物標志物平臺,、生物信息分析平臺等多個平臺,，能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體分離、鑒定,、內(nèi)含物（蛋白質(zhì),、mRNA、ncRNA）檢測及驗證的“一站式”外泌體研究服務(wù),。

那么如何開展外泌體研究,，第一步也是相當重要的一步就是收集外泌體含量高的樣本。外泌體存在于各種生物體液中,，如血液,、乳汁、尿液,，腦脊液,，那么如何有效的收集各種類型的樣本用于后續(xù)的外泌體分離呢，下面我們來簡單介紹下各類型外泌體樣本的具體收集方法,。

注意：收集血清樣本時一定不能加入抗凝劑,。

1) 采集外周血（建議早晨空腹抽血），迅速轉(zhuǎn)入不含EDTA的試管中,；

2) 室溫（22℃~25℃）下靜置30分鐘,，或4℃下靜置3~4小時，可見自行凝固,；

3) 吸取上清至新的離心管中,，4℃，8200×g離心10分鐘,；

4) 吸取上清至新的離心管中,，4℃，16000×g離心10分鐘,；

5) 小心吸取上清至新的離心管中（1.5ml離心管,，每管不超過1ml）， -80℃保存；

6）干冰寄送樣本,。

提示：建議送樣量5 mL 以上（大致需全血8-10mL）

血漿

注意：收集血漿樣本用于RNA研究時一定不要用肝素抗凝管,。

1) 采集外周血（建議早晨空腹抽血），迅速轉(zhuǎn)入EDTA抗凝管中,，渦旋或顛倒混合5～10 次,；

2) 在1小時（室溫）或2小時（4℃）內(nèi)進行血漿分離，8200×g離心10分鐘,；

3) 吸取上清至新的離心管中,，4℃，16000×g離心10分鐘,；

4) 小心吸取上清至新的離心管中（1.5ml離心管,，每管不超過1ml），-80℃保存,；

5）干冰寄送樣本,。

提示：建議送樣量5 mL以上（大致需全血8-10mL）

Tips: 血液樣本外泌體研究血清好還是血漿好？

血漿=血液-血細胞,；血清=血漿-纖維蛋白原-凝血因子,；血清是血液凝固之后收集的液體，在凝血過程中血小板會分泌大量的外泌體,，有研究發(fā)現(xiàn)血清中有接近50%的外泌體來自額外的分泌,，所以一般實驗會選擇血漿。在特殊情況下,，如研究與血小板相關(guān)疾病的時候,，血清比血漿更適合。此外,，在采血后最好盡快處理樣本,，因血液收集到收集管后，血細胞和血小板會繼續(xù)分泌外泌體

細胞上清

注意：細胞培養(yǎng)基必須使用去除外泌體的血清或者無血清培養(yǎng)基

1) 正常含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞24h左右,，貼壁細胞密度達到70%~80%,，懸浮細胞密度達到60%~70%,；

2) 將原有血清培養(yǎng)基更換為去除外泌體的血清或者無血清培養(yǎng)基（貼壁細胞直接去除原有培養(yǎng)基,，加入適量PBS緩沖液沖洗一次，更換新的培養(yǎng)基,；懸浮細胞4℃,，300×g離心10分鐘，收集細胞后,，加入適量PBS緩沖液沖洗一次,，更換新的培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng)；

3) 培養(yǎng)48-72小時后，根據(jù)細胞數(shù)量確定收取上清時間,；

4) 4℃,，300×g，離心10分鐘收集細胞上清,；

5) 4℃,，3000×g，離心15分鐘,，確保將細胞及細胞碎片去除干凈,；

6) 吸取上清，-80℃保存,；

7）干冰寄送樣本,。

提示：送樣量最好在50 mL 以上，不少于30ml

尿液

1) 收集清晨第一次尿液50ml,，注意避免細菌污染,，收集前注意飲食控制，前一晚22:00后禁食禁水,；

2) 4 ℃ ,，3000×g，離心15分鐘,，去除細胞或細胞碎片,；

3) 收集上清尿液分裝轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，-80℃保存,；

4）干冰寄送樣本,。

提示：送樣量最好在50 mL 以上

腦脊液

1) 收集腦脊液，收集過程中避免血液污染,；

2) 3000×g,，離心15分鐘，去除細胞或細胞碎片,；

3) 收集上清,，-80℃冰箱中保存；

4）干冰寄送樣本,。

提示：送樣量最好在20 mL 以上

注：以上建議的送樣量綜合考慮了外泌體的表征檢測（TEM,、NTA、WB）和組學(xué)研究（轉(zhuǎn)錄組,、蛋白質(zhì)組）的樣本需求量,。上述細胞上清送樣量主要指常規(guī)腫瘤細胞，對于其他類型細胞,，最好在送樣前進行預(yù)實驗,，以確定外泌體含量,。

目前外泌體的分離方法中應(yīng)用廣泛的是超速離心法和試劑盒抽提法，超速離心法是外泌體分離的金標準,，是高分文章常用的分離方法,，獲得的外泌體純度高。其原理主要是依據(jù)外泌體與其他微小囊泡密度和大小的不同而分離,，通過逐步提高離心速度,，有效去除細胞、細胞碎片和大囊泡,，收集高純度的外泌體,。外泌體抽提試劑盒分離外泌體省時省力，外泌體純度高,，SBI外泌體抽提試劑盒,，樣本需求量少，最少可從100ul血清或5ml細胞上清中分離外泌體,。利用超離或試劑盒法分離獲得的外泌體,，經(jīng)表征檢測確定后即可進行后續(xù)的組學(xué)研究。

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