熒光素酶報告實驗,雙熒光素酶報告基因檢測技術服務分子生物學?介紹
 

　　雙熒光素酶報告基因檢測是以熒光素(luciferin) 為底物來檢測螢火蛟光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化Iuciferin氧化成oyluciferin, 在luciferin氧化的過程中,，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence) ,，可通過熒光測定儀設備測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光，常應用于啟動子轉錄活性調控及miRNA靶基因驗證等向研究,。
 

　　雙熒光素酶通常是指螢火蛟光素酶和海腎熒光素,。其中熒火蛟光素是從甲蟲(Photinuspyralis)中分離得到，分子量為61kDa;而海腎(Renilla) 熒光素酶則是從海腎(Renillareniformis)中分離,分子量為36kDa,。這兩種酶的區(qū)別之一是他們的底物和輔因子不同:螢火蟲熒光素酶需要熒光素,、氧氣、 ATP和鎂離子同時存在才能發(fā)光;而海腎熒光素酶僅需要腔腸素(coelenterazine)和氧氣,。螢火熒光素酶和海腎熒光素酶的區(qū)別之二是發(fā)光的顏色不同:螢火蟲熒光素酶產生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色,波長550-570nm;而海腎熒光素酶產生藍光,，波長480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同,，所以在雙報告實驗中得到廣泛應用,。
 

　　雙熒光素酶報告基因檢測優(yōu)勢:單報告基因實驗往往會受到各種實驗條件的影響，而雙報告基因則通過共轉染的”對照”作為內參為試驗提供-基準線, 從而可以在較大程度上減小細胞活性和轉染效率等外在因素對實驗的影響,，使得數(shù)據結果更為可信,。雙熒光素酶報告基因檢測常用的載體有兩種策略。一種是兩種熒光素分別位于兩個載體上,第二種是兩種熒光素酶位于同一個載體上,。以一種為例,，這兩種載體分別為pMIR REPORT miRNA載體和pRL-TK載體,。經檢索發(fā)現(xiàn)，pMIR-REPORT miRNA載體是由Ambion開發(fā)的載體,，它用來克隆插入miRNA靶序列,，評估細胞內miRNA功能的載體。
 

　　另外的一個載體是pRL-TK載體,，這個載體是由Promega開發(fā)的,，pRL-TK是海腎熒光素酶報告載體，含有SV40增強子,，pMIR-REPORT miRNA這個載體主要是用于評估m(xù)iRNA與靶基因3’UTR的結合,，靶基因的3’UTR放在熒光素酶的后面，這個熒光素酶是熒火蟲熒光素酶,，而pRL-TK這個載體則表達海腎熒光素酶,，將這兩個質粒共同轉染進入293細胞中來檢測熒光時，pRL-TK這個質粒起到一個內參的作用,。
 

　　雙熒光素酶報告基因檢測技術服務分子生物學?內容
 

　　目的基因的調取及載體構建,；基因測序以及載體構建；將構建質粒轉染到目的細胞,；
 

　　使用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測,；比較處理組和對照組的熒光酶活性。
 

　　客戶須知
 

　　客戶需提供基因序列信息,，待研究轉錄因子信息,。服務中高效的轉染效率；使用優(yōu)質的熒光素酶報告基因檢測試劑盒,；提供給客戶目的基因的質粒和甘油菌,；提供原始的數(shù)據以及實驗報告。提供完整客觀準確完成的實驗報告,。實驗周期為4周,。