體外哺乳類細胞基因突變（HGPRT）試驗原理及注意事項
In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test
【試驗原理】
體外哺乳動物細胞基因突變試驗是利用培養(yǎng)的哺乳動物細胞作指示生物的體外遺傳毒理學(xué)試驗，可用于檢測有化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的基因突變，適用的細胞系包括小鼠淋巴瘤細胞（L5178Y）,，中國倉鼠肺細胞（V79）,，中國倉鼠卵巢細胞（CHO），人類淋巴母細胞（TK6）等,。這些細胞系,，常用的遺傳學(xué)終點是檢測胸苷激酶（TK）圖標，次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶（HPRT/HGPRT）圖標,，黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶（XPRT）基因突變,。TK、HPRT/HGPRT,、XPRT突變試驗可以檢測不同的遺傳事件譜,。
細胞在正常情況下，能產(chǎn)生HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）,，在含有6-硫代鳥嘌呤（6-thioguanine,6-TG）的選擇性培養(yǎng)液中,，HGPRT催化產(chǎn)生核苷-5，-單磷酸（NMP）,，NMP摻入DNA中致細胞死亡,。在致癌和（或）致突變物作用下，某些細胞X染色體上控制HGPRT的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變,，不能再產(chǎn)生HGPRT,， 從而使突變細胞對6-TG具有抗性作用，能夠在含有6-TG的選擇性培養(yǎng)液中存活生長,。在有或無代謝活化系統(tǒng)的條件下,，將細胞培養(yǎng)物暴露于受試物中適當時間，然后將細胞再傳代培養(yǎng),，在含有6-TG的選擇性培養(yǎng)液中,，突變細胞會繼續(xù)分裂并形成集落，計數(shù)突變集落形成數(shù),，計算突變頻率,，從而推斷受試物的致突變性。
【參考標準】
GB 15193.12-2014 體外哺乳類細胞HGPRT基因突變試驗
【材料和試劑】
細胞：常用中國倉鼠肺細胞株（V79）和中國倉鼠卵巢細胞株（CHO）,，其他如小鼠淋巴瘤細胞株（L5178Y）和人類淋巴母細胞株（TK6）亦可,。細胞在使用前應(yīng)進行有無支原體污染的檢查。
培養(yǎng)液：應(yīng)根據(jù)試驗所用系統(tǒng)和細胞類型來選擇適宜的培養(yǎng)基,。對于 V79和 CHO 細胞，常用-低必需培養(yǎng)基（MEM,，Eagle）,、改良 Eagle培養(yǎng)基（DMEM）加人10%胎牛血清和適量抗菌素。對于 TK6 和 L5178Y細胞，常用 RPMI 1640培養(yǎng)液,，加人10%馬血清（培養(yǎng)瓶培養(yǎng)）或20%馬血清（96孔板培養(yǎng)）和適量抗菌素（青霉素,、鏈霉素）。
胰蛋白酶/EDTA溶液：用無鈣,、鎂 PBS配制,，胰酶的濃度為0.05 %，EDTA 的濃度為0.02% ,胰蛋白酶與EDTA溶液按1:1混合,。-20℃儲存,。
活化系統(tǒng)：通常使用的是S9混合物。
選擇劑：6-硫代鳥嘌呤(6-TG),，建議使用終濃度為5μg/mL～15μg/mL,用碳酸氫鈉溶液(0.5 %)配制,。
預(yù)處理培養(yǎng)液(THMG/THG)：為減少細胞的自發(fā)突變頻率，在試驗前,，先將細胞加在含 THMG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h,，清除自發(fā)的突變細胞，然后再將細胞接種于THG(不含氨甲喋呤的THMG培養(yǎng)液)中培養(yǎng)1d～3d至細胞恢復(fù)正常生長周期和形態(tài),。
THMG 所含各物質(zhì)終濃度如下(除培養(yǎng)液成分外):
————胸苷,，5×10-6 mol/L；
————次黃嘌呤,，5×10-5 mol/L,；
————氨甲喋呤，4×10-7 mol/L,；
————甘氨酸,，1×10-4 mol/L；
【試驗方法】
一,、受試物
受試物配制：固體受試物應(yīng)溶解或懸浮于適合的溶媒中,，并稀釋至適當濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當濃度,。受試物應(yīng)在使用前現(xiàn)用現(xiàn)配,，否則就必須證實貯存不影響其穩(wěn)定性。
溶媒的選擇：溶媒必須是非致突變物,，不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),，不影響細胞存活和S9活性。首-選溶媒是蒸餾水,；對于不溶于水的受試物可選擇其他溶媒,，首-選二甲基亞礬(DMSO)，但使用時濃度不應(yīng)大于0.5%,。
對照：
每一項試驗中,，在有無代謝活化系統(tǒng)條件下均應(yīng)設(shè)陽性和陰性(溶媒)對照組,。
二,、劑量
-高濃度選擇：決定-高濃度的因素是細胞毒性,、受試物在試驗系統(tǒng)中的溶解度以及pH 或滲透壓的改變。
細胞毒性確定：應(yīng)使用指示細胞完整性和生長情況的指標,，在代謝活化系統(tǒng)存在和不存在兩種條件下確定細胞毒性,，例如相對集落形成率或相對存活率。應(yīng)在預(yù)試驗中確定細胞毒性和溶解度,。
濃度設(shè)置和-高濃度選擇：至少應(yīng)設(shè)置4個可供分析的濃度,。當有細胞毒性時，其濃度范圍應(yīng)包括從大毒性至幾乎無毒性,，通常濃度間隔系數(shù)在2～√10之間,；如-高濃度是基于細胞毒性，那么該濃度組的細胞相對集落形成率或相對存活率應(yīng)為 10%～20 %(不低于10% ),。對于那些細胞毒性很低的化合物,，-高濃度應(yīng)是5μL/mL、5mg/mL或0.01mol/L,。對于相對不溶解的物質(zhì),，其-高濃度應(yīng)達到或超過在細胞培養(yǎng)狀態(tài)下的溶解度限值；-好在試驗處理開始和結(jié)束時均評價溶解度,，因為由于S9等的存在,，試驗系統(tǒng)內(nèi)在暴露過程中溶解度可能發(fā)生變化，不溶解性可用肉眼鑒別,，但沉淀不應(yīng)影響觀察,。
三、試驗步驟和觀察指標
貼壁生長細胞的試驗步驟和觀察指標：
懸浮生長細胞的試驗步驟和觀察指標：
【數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價】
貼壁生長細胞 HGPRT試驗數(shù)據(jù)處理：
細胞毒性：以相對于溶媒對照組的集落形成率表示細胞毒性,。即以溶媒對照的集落形成率為100%(1.00),求出各受試物組的相對值。
懸浮生長細胞 HGPRT試驗數(shù)據(jù)處理：
受試物組在任何一個劑量條件下的突變頻率為陰性（溶媒）對照組的3倍或3倍以上,，可判定為陽性。
受試物組的突變頻率增加,，與陰性（溶媒）對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)趨勢,，則可判定為陽性,。
受試物組在任何一個劑量條件下引起具有統(tǒng)計學(xué)意義的增加并有可重復(fù)性，則可判定為陽性,。
不符合上述陽性結(jié)果判定標準,，則可判定為陰性。
【試驗報告】
結(jié)論：本試驗條件下受試物是否具有致突變作用,。
【試驗解釋】
若陰性對照中,，集落形成率或存活率低于50%，結(jié)果應(yīng)不采用,。各實驗室選用的陽性對照突變頻率有一定范圍,，若受試物的結(jié)果為陰性或弱陽性時，陽性對照的誘變率應(yīng)達正常值的下限以上,，否則結(jié)果不能成立,。
HGPRT基因突變試劑盒
北京匯智泰康針對體外哺乳類細胞HGPRT基因突變試驗開發(fā)HGPRT基因突變試劑盒，試劑盒提供了進行體外哺乳類細胞HGPRT基因突變試驗所需的主要試劑和細胞(V79),，可用于評價受試物的致突變作用,。所用細胞和試劑均符合國標GB 15193.12-2014 《食品安全-國家標準 體外哺乳類細胞HGPRT基因突變試驗》的要求。
20mL×24體系/盒,，4個劑量組,。
【產(chǎn)品使用說明】
1、細胞復(fù)蘇
收到試劑盒后,，請盡快復(fù)蘇細胞,。
從-70℃冰箱中取出細胞，于37℃水浴融化,，離心,，棄上清，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸,；再次離心,，棄上清，用10% FBS培養(yǎng)基,，接種于細胞培養(yǎng)瓶中,，放置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后期細胞傳代比例為1:3,。
2,、自發(fā)突變細胞清除
取對數(shù)生長期細胞懸液，于含1% （V/V）的THMG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，離心,，洗滌后將細胞接種于含1% （V/V）的THG（不含氨甲喋呤）培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)1d~3d,，至細胞恢復(fù)正常生長周期和形態(tài)。
注：為確保試驗的可行性,，試驗中所用細胞的自發(fā)突變率應(yīng)在5×10-6~20×10-6之間,，清除自發(fā)突變的細胞傳代使用不得超過1個月，且每次試驗前需將細胞清除自發(fā)突變,。
3,、染毒處理
將5×105個細胞接種于直徑為100mm的平皿中，于37℃,，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)24h,。吸去培養(yǎng)液，PBS洗兩次,，加入一定量的無血清培養(yǎng)液,、一定濃度的受試物及10%S9混合液（無需代謝活化者用無血清培養(yǎng)液或S9反應(yīng)液PS補足），置于37℃,，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~6h，結(jié)束后吸去含受試物的培養(yǎng)液,，用PBS洗細胞兩次,，換入含10%血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)19~22h,，每個試驗組平行處理兩份培養(yǎng)物,。
（1）S9混合液及染毒用細胞液配制
注：在試驗過程中，需根據(jù)實際需求,，調(diào)整配制量,。
（2）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案（試劑盒僅提供1次完整實驗的4個劑量組所需）
注：1.染毒時間可根據(jù)實際情況進行調(diào)整，一般為3h~6h,，必要時可延長到1個或多個細胞周期,。
2.如進行短時間染毒，可直接加入稀釋并混合均勻的絲裂-霉素C,；若進行24h染毒,，則需將絲裂-霉素C再稀釋2.5倍后再加入。
4,、表達培養(yǎng)
接觸受試物的細胞繼續(xù)培養(yǎng)19~22h后,，用胰酶-EDTA消化，待細胞脫落后,，加入含10%血清的培養(yǎng)液終止消化,，混勻，放入離心管中800r/min~1000r/min的速度離心5~7min，棄上清液,，制成細胞懸液,，計數(shù)，以5×105個接種于直徑為100mm的平皿,，3d后傳代,，仍接種5×105個細胞培養(yǎng)3d（-佳表達時間為6d~8d）。
5,、細胞毒性測定
將上述*消化計數(shù)后的細胞每皿接種200個,，每組5個皿，37℃,、5%的二氧化碳條件下培養(yǎng)7d,，固定，Giemsa染色,，計數(shù)每皿集落數(shù),。
以相對于溶媒對照組的集落形成率表示細胞毒性，即以溶媒對照的集落形成率為100%,，求出各受試物組的相對值,。計算公式見（1）：
A=B/C×100%------------------------------------------（1）
式中：A—相對集落形成率，%,；B—受試物組集落形成率,，%；C—溶媒對照組集落形成率,，%,。
6、突變體的選擇和集落形成率的測定
表達培養(yǎng)結(jié)束后,，消化細胞,，分種，每組5個皿,，每皿接種200個細胞,，不加6-TG，7d后固定,，Giemsa染色,，統(tǒng)計每皿集落數(shù)，計算集落形成率,。同時另做突變頻率測定,，每組5個皿，每皿接種2×105個細胞,，待細胞貼壁后,，按照千分之一的比例加入6-TG，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8~10d后固定，Giemsa染色,，統(tǒng)計每皿集落數(shù),，計算突變頻率。
集落形成率計算見式（2）：
D=E/F×100%-------------------------------------------（2）
式中：D—集落形成率,，%,；E—實際存活的細胞集落數(shù)；F—接種細胞數(shù),。
突變頻率計算見式（3）：
式中：G—突變頻率,；H—突變集落數(shù)；I—接種細胞數(shù),；D—集落形成率,。
7、結(jié)果評價
7.1 實驗成立條件
若陰性對照中,，集落形成率低于50%,，結(jié)果應(yīng)不予采用。
若受試物的結(jié)果為陰性或弱陽性時,，陽性對照的誘變率應(yīng)達正常值的下線以上,，否則結(jié)果不成立。
7.2 結(jié)果判定
受試物組在任何一個劑量下的突變頻率為陰性（溶媒）對照組的3倍或3倍以上,，可判定為陽性,。
受試物組的突變頻率增加，與陰性（溶媒）對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義,，并有劑量-反應(yīng)趨勢，則可判定為陽性,。
受試物組在任何一個劑量條件下引起具有統(tǒng)計學(xué)意義的增加并有可重復(fù)性,，則可判定為陽性。
不符合上述陽性結(jié)果判定標準,，則可判定為陰性,。
【注意事項】
實驗前請自行準備胎牛血清、RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液,、胰酶-EDTA,、Giemsa染色液、100mm平皿,、滅菌槍頭,、無菌移液管、二氧化碳培養(yǎng)箱,、振蕩器,、50mL離心管等，所有耗材需做無菌處理。
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