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細胞屬性：

方法簡介

公司實驗室分離的小鼠陰道壁成纖維采用-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的小鼠陰道壁成纖維經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌等。

細胞簡介：

小鼠陰道壁成纖維細胞分離自陰道組織,；陰道位于膀胱,、尿道和直腸之間，是一個富有彈性的管狀器官,。它在人類生殖過程中具有多種生理功能,，是連接子宮與外陰的通道，是排出月經(jīng)血,、娩出嬰兒的必經(jīng)之路,，也是一個重要的性交器官。陰道壁按組織學由外到內(nèi)分三層，即黏膜層,、肌層和外膜,。1）黏膜層由上皮和固有膜組成。上皮較厚,，為復層鱗狀上皮,，從基底層到表層由基底層、旁基底層,、中間層和表層組成,。沒有角化層。陰道粘膜的基底層呈細波紋狀起伏,。2）肌層由平滑肌組織構成,，肌束排列不規(guī)則，縱行和環(huán)形互相交錯,。肌束間有較多的結(jié)締組織和彈性纖維,。陰道外口有環(huán)形的橫紋肌稱括約肌。3）外膜層為纖維膜,，由結(jié)締組織構成,，內(nèi)含豐富的彈性纖維、靜脈叢,、淋巴管和,。大鼠陰道壁成纖維細胞主要分離自外膜層，成纖維細胞（Fibroblast）是疏松結(jié)締組織的主要細胞成分,，由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來,。成纖維細胞較大，輪廓清楚,，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構,，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯,。成纖維細胞功能活動旺盛,，細胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動,，在一定條件下,，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉(zhuǎn)化；成纖維細胞對不同程度的細胞變性,、壞死和組織缺損的修復有著十分重要的作用,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳2-3代左右；2代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片,，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍,。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：