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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的小鼠小氣道平滑肌采用-膠原酶聯(lián)合消化法結合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的小鼠小氣道平滑肌經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌等。

細胞簡介：

小鼠小氣道平滑肌細胞分離自小氣道組織,；臨床上通常將內(nèi)徑小于2mm的小細支氣管稱為小氣道,。小氣道具有氣流阻力小，但易阻塞的特點,。在平靜吸氣時,，空氣進入狹窄的鼻咽部，產(chǎn)生渦流,。由于小氣道已無軟骨支持,，在脫離纖維鞘嵌入肺組織后，管腔通暢性不象軟骨性氣道，易于受胸腔的壓力變化的影響,。小氣道上皮細胞形成連續(xù)呼吸道內(nèi)層，作為隔絕外界有害物質(zhì)的物理和功能屏障發(fā)揮著的作用,。小氣道位于肺泡和氣管的交界處,，這些細胞在功能上能夠調(diào)節(jié)免疫反應、產(chǎn)生化學因子進行宿主防御,、表達粘附分子,，并可能通過HLA-DR表達呈遞抗原；它們還能產(chǎn)生液體有助于肺液的平衡,。許多呼吸道疾病,，如哮喘、支氣管炎,、慢性阻塞性肺病和囊性纖維化,，都涉及呼吸道表面上皮細胞的破壞；小氣道上皮細胞的培養(yǎng)可為防止呼吸道擴增疾病和重塑提供新的治療選擇,。小氣道平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后,，可見細胞貼壁伸展，細胞形態(tài)大小不一,，呈梭形,、不規(guī)則形、三角形或扇形,，核卵圓形,、居中；2周后細胞匯合,，多數(shù)細胞伸展呈長梭形,，胞漿豐富，有分枝狀突起,，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長,，高低起伏；細胞密度低時,，常交織成網(wǎng)狀,；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀,。傳代后細胞生長較快,，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學特征和生長特點,。小氣道的生理功能特點：①小氣道阻力?。虎跉饬魉俣嚷虎劭烧{(diào)節(jié)控制通氣與血流比例,。小氣管平滑肌細胞主要功能：①保持氣道張力維持小氣道形態(tài),；②肺小氣道進行氣體交換，病變可引起換氣功能障礙,；③炎癥,、痰液阻塞或當氣道外壓大于氣道內(nèi)壓時容易造成小氣道閉合、萎陷,。小氣管平滑肌細胞與主要病生理變化：①支氣管炎,；②肺氣腫；③慢性阻塞性肺疾病,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基,，含FBS、EGF,、bFGF,、Insulin、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：成纖維細胞樣

傳代特性：可傳2-3代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

小鼠小氣道平滑肌細胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存,。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次,，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側,，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。