小鼠神經(jīng)干原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 NCI-H295R(人上腺皮質(zhì)腺癌細(xì)胞) NCI-H2087 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 1ml/T75 PANC-1, 人胰腺癌細(xì)胞 Human HBL-100 人整合 SV40基因的上皮細(xì)胞 大鼠原代外周血單個核細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠干采用消化后差速貼壁,，結(jié)合干細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠干經(jīng)Nestin免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌,、酵母和真菌等。

 

細(xì)胞簡介：

小鼠干細(xì)胞分離自腦皮層組織,；大腦分左右兩個半球,，大腦皮質(zhì)（灰質(zhì)）覆蓋著每個大腦半球的大部分,，它是元胞體集中的地方,。內(nèi)部則是由纖維或髓鞘構(gòu)成的白質(zhì)。每一個半球都有三個面,，即外側(cè)面（約占整個皮質(zhì)面積的1/3）,、內(nèi)側(cè)面和底面（占2/3的面積）；半球表面有很多深淺不等的溝或裂,，溝或裂之間的隆起叫回,，它們大大增加了大腦的表面積；大腦外側(cè)面重要的溝,、裂有大腦外側(cè)裂,、頂枕裂和中央溝,。由于三溝裂之界隔，使大腦皮質(zhì)組分為額葉,、頂葉,、顳葉、枕葉四大部分,。干細(xì)胞具有分化為元,、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新,，并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞群,。干細(xì)胞是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生組織的各類細(xì)胞,。需要強(qiáng)調(diào)的是,，在腦脊髓等所有組織中，不同的干細(xì)胞類型產(chǎn)生的子代細(xì)胞種類不同,，分布也不同,。干細(xì)胞作為干細(xì)胞的一種，它具有其它所有干細(xì)胞的基本特征：具有自我維持和自我更新能力,，具有多種分化潛能,，具有分化為本系統(tǒng)大部分類型細(xì)胞的能力，這種自我更新和分化潛能可以維持相當(dāng)長的時間甚至終生,，對損傷和疾病具有反應(yīng)能力,。干細(xì)胞在疾病、損傷狀態(tài)下具有增殖,、遷移,，并向細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力,，已成為系統(tǒng)損傷修復(fù)和再生研究的熱點(diǎn),，體外建立穩(wěn)定的干細(xì)胞培養(yǎng)模型是其基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用的前提。干細(xì)胞在培養(yǎng)3-4d后,，可形成球,，球在培養(yǎng)基中呈懸浮生長，予以更換半量培基,，1周后用吸管輕柔吹打球形克隆成為小的球和單細(xì)胞懸液,，將部分細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，2×105個細(xì)胞/瓶,，每7-10d傳代1次,，每隔3d離心更換半量培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)條件不變。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含B-27 Supplement,、EGF,、bFGF、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 懸浮

細(xì)胞形態(tài) 球形

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%,，Accutase

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存,。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。