兔椎間盤髓核原代細胞

兔椎間盤髓核細胞分離椎間盤組織,；椎間盤是位于脊柱兩椎體之間，分為中央部的髓核,，富于彈性的膠狀物質(zhì),；周圍部的纖維環(huán)，由多層纖維軟骨環(huán)按同心圓排列,。上下有軟骨板,，是透明軟骨復(fù)蓋于椎體上，下面骺環(huán)中間的骨面,。上下的軟骨板與纖維環(huán)一起將髓核密封起來,。纖維環(huán)由膠原纖維束的纖維軟骨構(gòu)成，位于髓核的四周。纖維環(huán)的纖維束相互斜行交叉重疊,，使纖維環(huán)成為堅實的組織,，能承受較大的彎曲和扭轉(zhuǎn)負荷。髓核,，是乳白色半透明膠狀體，富于彈性,，為椎間盤結(jié)構(gòu)的一部分,，位于兩軟骨板與纖維環(huán)之間。由縱橫交錯的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即軟骨細胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構(gòu)成的彈性膠凍物質(zhì),。嬰幼兒時期的髓核含水量為80%-90%,，即使到了老年，其含水量也在70%上下,。髓核在出生時體積大而松散,，位于椎間盤的中央，至成年時位置移至椎間盤的中后部,；在成年以前構(gòu)成髓核的主要物質(zhì)是大量蛋白多糖復(fù)合體,、膠原纖維和纖維軟骨，隨著年齡的增長,，髓核中的蛋白多糖解聚增多,，水分逐漸減少,，膠原增粗并逐漸被纖維軟骨所替代。

產(chǎn)品名稱：兔椎間盤髓核細胞

組織來源：椎間盤組織

產(chǎn)品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

培養(yǎng)基 含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每3-4天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 梭形,、多角形

傳代特性 可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

方法簡介

公司實驗室分離的兔椎間盤髓核采用膠原酶-蛋白酶混合消化法并結(jié)合軟骨細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的兔椎間盤髓核經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌、酵母和真菌等,。

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存,。

1）復(fù)蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘,，棄去上清液,，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細胞懸液加入 10cm 皿中,，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度,。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存,。下面 T25 瓶為類,；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后,，PBS 清洗一遍后加入 1ml ,，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計數(shù)板計數(shù),。