兔真皮成纖維原代細胞公司出售的產(chǎn)品：人原代腹膜間皮細胞 LLC(小鼠肺癌細胞) LtK-11 C3H/An小鼠結締組織細胞(L929-TK-) 1ml/T75 NCI-H358 人非小細胞肺癌細胞 Caco-2 人結腸腺癌細胞 小鼠原代肺泡巨噬細胞

兔真皮成纖維原代細胞

兔真皮成纖維細胞分離自真皮組織,；皮膚組織來源包括頭部,、臉部、手,、腳,、腿、背部,、腹部,、包皮等體表部位皮膚,，可依據(jù)需求選用；真皮,，位于表皮深層,，向下與皮下組織相連，真皮結締組織的膠原纖維和彈性纖維互相交織在一起,，埋于基質內(nèi),。其內(nèi)分布著各種結締組織細胞和大量的膠原纖維彈性纖維，使皮膚既有彈性,，又有韌性,。其由兩層組成——乳頭層與網(wǎng)狀層。真皮的結構組成是膠原蛋白,、彈性纖維以及基質,。成纖維細胞（Fibroblast）是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞分化而來,。成纖維細胞較大,，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構,，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形,，核仁大而明顯,。成纖維細胞功能活動旺盛,，細胞質嗜弱堿性，具明顯的蛋白質合成和分泌活動,，在一定條件下,，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉化；成纖維細胞對不同程度的細胞變性,、壞死和組織缺損的修復有著十分重要的作用,。剛分離的真皮成纖維細胞呈圓形、折光性良好,，懸浮于培養(yǎng)基中,。30min細胞貼壁，其中部分開始伸出偽足,，表現(xiàn)為小的突起,；6h后細胞基本貼壁，伸展成梭形,，胞核清晰,，分布較均勻，散在生長,，不聚集成團,；細胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密,，有的交叉重疊生長,，平坦、胞體較大,，細胞質透明,，細胞核較大，呈橢圓形,，顏色淡,。細胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀,；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,。真皮成纖維細胞在生理條件下的主要功能包括：構造和維持組織的正常形態(tài)，合成和釋放細胞外基質以及組織損傷后及時大量聚集修復損傷組織,。

產(chǎn)品名稱：兔真皮成纖維細胞

組織來源：皮膚

產(chǎn)品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：成纖維細胞樣

傳代特性：可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

兔真皮成纖維細胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

方法簡介

實驗室分離的兔真皮成纖維采用先蛋白酶消化、后-膠原酶混合消化法結合差速貼壁法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質量檢測

實驗室分離的兔真皮成纖維經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌、酵母和真菌等,。

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存,。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘,，棄去上清液,，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次,。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存,。下面 T25 瓶為類,；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后,，PBS 清洗一遍后加入 1ml ,，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計數(shù)板計數(shù),。