兔小腦顆粒原代細胞

兔小腦顆粒細胞分離自小腦皮層組織；元是系統基本的結構與功能單位,，小腦顆粒元是體積較小的元,，直徑約10μm，在中樞系統中含量非常豐富,，近乎元數量的一半,。由于小腦元的生長、分化和大腦皮層元相似,，而且數量多,、便于取材，因此小腦顆粒元是研究元生長發(fā)育、軸突再生及疾病發(fā)生機制和臨床藥理的重要手段,。小腦顆粒元是小腦主要的中間元,，在哺乳動物的小腦內數量為豐富。顆粒元的軸突與苔狀纖維和爬行纖維相聯系,，形成小腦皮層內的元環(huán)路,，在小腦的活動中起著非常重要的作用。在動物傳染性海綿狀腦病中,，病變可波及小腦顆粒元,，導致小腦皮層的元環(huán)路受損，從而呈現性行為失調,。研究小腦顆粒元在動物傳染性海綿狀腦病病理學變化中的反應,、病理發(fā)生的機理特別是分子機理，有賴于小腦顆粒元細胞模型的建立,。小腦顆粒細胞的軸突是沿冠狀軸分布的平行纖維,，正是這種排列保證了興奮的單向傳導，這是小腦功能理論中的關鍵假設,，小腦顆粒細胞通過g-氨基丁酸接受戈爾吉細胞的抑制性突觸的信息傳入,。

產品名稱：兔小腦顆粒細胞

組織來源：腦

產品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

包被條件：PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基：含B-27、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：元細胞樣

傳代特性：屬于終末分化細胞,；屬于不增殖細胞群

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

兔小腦顆粒細胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

方法簡介

實驗室分離的兔小腦顆粒采用消化法結合元專用培養(yǎng)基、化學試劑抑制法篩選制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質量檢測

實驗室分離的兔小腦顆粒經NSE免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌、酵母和真菌等,。

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存,。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻,。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液,，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次,。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存,。下面 T25 瓶為類,；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后,，PBS 清洗一遍后加入 1ml ,，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計數板計數,。