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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔腎成纖維采用-膠原酶混合消化法結合差速貼壁法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的兔腎成纖維經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌、酵母和真菌等,。

細胞簡介：

兔腎成纖維細胞分離自腎組織,；腎臟是機體的重要器官，它的基本功能是生成尿液,，借以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物,、毒物，同時經(jīng)重吸收功能保留水份及其他有用物質(zhì),，如葡萄糖,、蛋白質(zhì)、氨基酸,、鈉離子,、鉀離子、等,，以調(diào)節(jié)水,、電解質(zhì)平衡及維護酸堿平衡。腎臟同時還有內(nèi)分泌功能,，生成腎素,、促紅細胞生成素、活性D3,、前列腺素,、激肽等，又為機體部分內(nèi)分泌激素的降解場所和腎外激素的靶器官,。腎臟的這些功能,，保證了機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進行,。成纖維細胞（Fibroblast）是疏松結締組織的主要細胞成分,，由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來,。成纖維細胞較大，輪廓清楚,，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構,，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯,。成纖維細胞功能活動旺盛,，細胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動,，在一定條件下,，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉化；成纖維細胞對不同程度的細胞變性,、壞死和組織缺損以及骨創(chuàng)傷的修復有著十分重要的作用,。腎成纖維細胞是腎臟結締組織中重要的細胞類型，在體外培養(yǎng)中,，一般大致成梭形,、多角形或不規(guī)則形等，為貼壁生長型細胞,。剛分離的腎成纖維細胞呈圓形,、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中,。30min細胞貼壁,，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起,；6h后細胞基本貼壁,，伸展成梭形，胞核清晰,，分布較均勻,，散在生長，不聚集成團,；細胞生長迅速,，5-7天即呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密,，有的交叉重疊生長,，平坦、胞體較大,，細胞質(zhì)透明,，細胞核較大，呈橢圓形,，顏色淡,。細胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀,；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,。其主要功能有：①組成過濾屏障內(nèi)壁的重要部分；②在炎癥和致血栓物質(zhì)的刺激合成必要的生物活性分子,；③受損后影響系膜細胞和上皮細胞,，進而影響腎臟病變。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：成纖維細胞樣

傳代特性：可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

兔腎成纖維細胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次,，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側,，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基,。

3,、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

公司產(chǎn)品：