兔神經(jīng)干原代細胞

兔干細胞分離自腦皮層組織,；大腦分左右兩個半球,，大腦皮質(zhì)（灰質(zhì)）覆蓋著每個大腦半球的大部分,，它是元胞體集中的地方。內(nèi)部則是由纖維或髓鞘構(gòu)成的白質(zhì),。每一個半球都有三個面,，即外側(cè)面（約占整個皮質(zhì)面積的1/3）、內(nèi)側(cè)面和底面（占2/3的面積）,；半球表面有很多深淺不等的溝或裂,，溝或裂之間的隆起叫回，它們大大增加了大腦的表面積,；大腦外側(cè)面重要的溝,、裂有大腦外側(cè)裂、頂枕裂和中央溝,。由于三溝裂之界隔,，使大腦皮質(zhì)組分為額葉、頂葉,、顳葉,、枕葉四大部分。干細胞具有分化為元,、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力,，能自我更新，并足以提供大量腦組織細胞的細胞群,。干細胞是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細胞,，它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生組織的各類細胞。需要強調(diào)的是,，在腦脊髓等所有組織中,，不同的干細胞類型產(chǎn)生的子代細胞種類不同，分布也不同,。干細胞作為干細胞的一種,，它具有其它所有干細胞的基本特征：具有自我維持和自我更新能力，具有多種分化潛能,，具有分化為本系統(tǒng)大部分類型細胞的能力,，這種自我更新和分化潛能可以維持相當(dāng)長的時間甚至終生，對損傷和疾病具有反應(yīng)能力,。干細胞在疾病,、損傷狀態(tài)下具有增殖、遷移,，并向細胞,、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞分化的能力，已成為系統(tǒng)損傷修復(fù)和再生研究的熱點,，體外建立穩(wěn)定的干細胞培養(yǎng)模型是其基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用的前提,。干細胞在培養(yǎng)3-4d后,，可形成球，球在培養(yǎng)基中呈懸浮生長,，予以更換半量培基,，1周后用吸管輕柔吹打球形克隆成為小的球和單細胞懸液，將部分細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中,，2×105個細胞/瓶,，每7-10d傳代1次，每隔3d離心更換半量培養(yǎng)基1次,，培養(yǎng)條件不變,。

產(chǎn)品名稱：兔神經(jīng)干細胞

組織來源：腦

產(chǎn)品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

培養(yǎng)基：含B-27 Supplement、EGF,、bFGF,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：懸浮

細胞形態(tài)：球形

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%,，Accutase

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

兔干細胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

方法簡介

實驗室分離的兔干采用消化后差速貼壁,，結(jié)合干細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的兔干經(jīng)Nestin免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌、酵母和真菌等,。

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞,，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集,，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

1）復(fù)蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻,。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液,，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并 檢查細胞密度,。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng),。

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次,。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分 變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液,，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時,，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類,；

1. 細胞凍存時,，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ,，細胞變圓 脫 落后,，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù),。