兔胚胎肢芽間充質(zhì)干原代細胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代子宮平滑肌細胞 細胞名稱 種屬 人脂肪細胞培養(yǎng)試劑盒 人脂肪細胞培養(yǎng) 小鼠肺動脈成纖維細胞培養(yǎng)基 100mL 胃粘膜上皮細胞 大鼠原代腸微血管內(nèi)皮細胞

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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔胚胎肢芽間充質(zhì)干采用-膠原酶聯(lián)合消化法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的兔胚胎肢芽間充質(zhì)干經(jīng)CD90免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌,、酵母和真菌等,。

 

細胞簡介：

兔胚胎肢芽間充質(zhì)干細胞分離自胚胎肢芽；胚胎肢芽存在于兩棲類以上的大多數(shù)脊椎動物胚胎中,，在四肢發(fā)生的初期階段,，在身體兩側(cè)有呈芽狀的突起，內(nèi)部是中胚層側(cè)板的體壁板垱厚形成,，表面有表皮覆蓋,。在這個中胚層區(qū)肢芽迅速伸長，不久,，在其前端即見有指的突起,。在此時期間，其內(nèi)部的中胚層分化成軟骨,、肌肉等,。這些分化組織,，在將肢芽作分離培養(yǎng)的時候也可以獲得,。根據(jù)對兩棲類的有尾類的研究，作為肢原基各部的胚發(fā)能力,，肢芽物質(zhì)的大部分是位于背半部,，而前半部主要參與基部形成，后半部參與前端的形成,。在實驗上,，即使將肢的原基分成二半，每一半調(diào)整好都可形成基本上近于正常形態(tài)的肢體,，而且肢體各軸的極性和側(cè)性也逐漸決定,。間充質(zhì)干細胞（MSC）是屬于中胚層的一類多能干細胞,，主要存在于結締組織和器官間質(zhì)中，是具有高度自我更新和多向分化潛能的干細胞,；這些細胞可以通過分裂維持自身細胞的特性和數(shù)量,，并在特定條件下轉(zhuǎn)變成為一種或多種構成機體組織或器官的細胞，從而在組織修復等方面發(fā)揮積極作用,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：成纖維細胞樣

傳代特性：可傳3-5代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

兔胚胎肢芽間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細胞培養(yǎng)方法：

1,、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞,，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片,，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。

公司產(chǎn)品：