兔顳下頜關(guān)節(jié)軟骨原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代脂肪細(xì)胞 人臍動脈內(nèi)皮細(xì)胞 Human 人腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒 人腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基 100mL 主動脈內(nèi)皮細(xì)胞 大鼠原代肝竇內(nèi)皮細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔顳下頜關(guān)節(jié)軟骨采用膠原酶聯(lián)合蛋白酶消化制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的兔顳下頜關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌,、酵母和真菌等。

 

細(xì)胞簡介：

兔顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離自顳下頜關(guān)節(jié)軟骨組織,，顳下頜關(guān)節(jié)又稱顳頜關(guān)節(jié)"或下頜關(guān)節(jié)",。由下頜頭與顳骨下頜窩和關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)組成，左右合成一聯(lián)合關(guān)節(jié),，主理張口閉口和咀嚼運動,。關(guān)節(jié)囊松弛，側(cè)方為內(nèi),、外側(cè)韌帶所加強,。囊內(nèi)的關(guān)節(jié)盤呈卵圓形，由纖維軟骨組成,，區(qū)分為前,、中、后三部分,。上面呈鞍狀,，前凹后凸，與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)和下頜窩的凸凹輪廓相對應(yīng),；下面凹正對下頜頭,，周緣與關(guān)節(jié)囊相接，前緣與穿過關(guān)節(jié)囊的翼外肌腱相連,。關(guān)節(jié)盤將關(guān)節(jié)腔分成上、下兩半,。關(guān)節(jié)外更有蝶下頜韌帶(蝶棘至下頜小舌)和莖突下頜韌帶(莖突至下頜角)予以加固,。關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，表面光滑、呈淡藍(lán)色,、有光澤,，它是由一種特殊的叫做致密結(jié)締組織的膠原纖維構(gòu)成的基本框架，這種框架呈半環(huán)形,，類似拱形球門,，其底端緊緊附著在下面的骨質(zhì)上，上端朝向關(guān)節(jié)面,，這種結(jié)構(gòu)使關(guān)節(jié)軟骨緊緊與骨結(jié)合起來而不會掉下來,，同時當(dāng)受到壓力時候，還可以有少許的變形,，起到緩沖壓力的作用,。在這些纖維之間，散在分布著軟骨細(xì)胞,，軟骨細(xì)胞由淺層向深層逐漸由扁平樣至橢圓或圓形的細(xì)胞組成,，這些軟骨細(xì)胞維持關(guān)節(jié)軟骨的正常代謝。關(guān)節(jié)軟骨沒有支配,，也沒有血管,，其營養(yǎng)成分必須從關(guān)節(jié)液中取得，而其代謝廢物也必須排至關(guān)節(jié)液中,，關(guān)節(jié)軟骨的這種營養(yǎng)代謝必須通過關(guān)節(jié)運動,，使關(guān)節(jié)軟骨不斷的受到壓力刺激才行，所以關(guān)節(jié)運動對于維持關(guān)節(jié)軟骨的正常結(jié)構(gòu)起重要的作用,。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞位于關(guān)節(jié)軟骨陷窩內(nèi),。幼稚的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞位于關(guān)節(jié)軟骨組織的表層，單個分布,、體積較小,、呈橢圓形，長軸與關(guān)節(jié)軟骨表面平行,，越向深層的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體積之間增大呈圓形,，細(xì)胞核圓形或卵圓形、染色淺,，細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性,，常見數(shù)量不一的脂滴。成熟的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞多2-8個成群分布于關(guān)節(jié)軟骨陷窩內(nèi),，這些關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞由同一個母細(xì)胞分裂增殖而成,，稱為同源細(xì)胞群。電鏡下,，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有突起和皺褶,，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體,。在組織切片中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞收縮為不規(guī)則形,，在軟骨囊和細(xì)胞之間出現(xiàn)較大的腔隙,。體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對于研究其生理功能、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義,。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率：每3-4天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：梭形,、多角形

傳代特性：可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

兔顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基,。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透,。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察,。