兔脊髓神經(jīng)元原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代乳腺成纖維細(xì)胞 小鼠黑色素瘤細(xì)胞 英文名稱： b16 人直腸平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒 人直腸平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠尿道上皮細(xì)胞培養(yǎng)基 100mL 實(shí)質(zhì)細(xì)胞 大鼠原代腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

公司實(shí)驗(yàn)室分離的兔脊髓元采用膠原酶&酶聯(lián)合消化法,、元專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選結(jié)合化學(xué)試劑抑制法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

公司實(shí)驗(yàn)室分離的兔脊髓元經(jīng)β-Tubulin免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌,、酵母和真菌等。

 

細(xì)胞簡介：

兔脊髓元細(xì)胞分離自脊髓組織,；脊髓是細(xì)細(xì)的管束狀的結(jié)構(gòu),，位于脊柱的椎管內(nèi)且被脊椎保護(hù)；是源自腦的中樞系統(tǒng)延伸部分,。中樞系統(tǒng)的細(xì)胞依靠復(fù)雜的聯(lián)系來處理傳遞信息,。脊髓的主要功能是傳送腦與外周之間的信息。人和脊椎動物中樞系統(tǒng)的一部分,，在椎管里面,，上端連接延髓，兩旁發(fā)出成對的,，分布到四肢,、體壁和內(nèi)臟。脊髓的內(nèi)部有一個(gè)H形(蝴蝶型)灰質(zhì)區(qū),，主要由細(xì)胞構(gòu)成,；在灰質(zhì)區(qū)周圍為白質(zhì)區(qū)，主要由有髓纖維組成,；脊髓是許多簡單反射的中樞,。脊髓兩旁發(fā)出許多成對的(稱為脊)分布到全身皮膚、肌肉和內(nèi)臟器官,。脊髓是周圍與腦之間的通路,，也是許多簡單反射活動的低級中樞,。按脊的出入可把脊髓也分為相應(yīng)的31節(jié)，31對脊就是由不同的脊椎發(fā)出的,。系統(tǒng)基本的結(jié)構(gòu)和功能單位是元,，即細(xì)胞，其大小和外觀在中樞系統(tǒng)中差異很大,。但都具有胞體和樹突,、軸突。胞體又叫核周體,，內(nèi)含絲,、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、游離核糖體和一個(gè)有明顯核仁的核。一些大元突起的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可用Nissl染色顯示,，在光鏡下是灰藍(lán)色斑塊狀,，稱為尼氏小體。樹突和軸突是元的突起,，能在元之間傳遞電沖動,，突起的大小和形態(tài)各不相同，很難用常規(guī)的顯微鏡鑒別,。脊髓組織內(nèi)含有大量膠質(zhì)細(xì)胞,，元含量少，分離純化難度大,，且脊髓元細(xì)胞是高度分化的終末細(xì)胞,，不能分裂增殖，培養(yǎng)要求高,。剛接種的脊髓元呈圓形,，體積小，透亮,，無突起,。培養(yǎng)2-3d，可見胞體增大,，突起增多延長,；培養(yǎng)6-7d，細(xì)胞體大飽滿,，突起明顯增加延長并交織成網(wǎng),，光暈明顯，立體感強(qiáng),。培養(yǎng)20d后,，死亡細(xì)胞明顯增加,，細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)空泡，突起粗細(xì)不均,，甚至脫壁,，發(fā)生細(xì)胞崩解。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基 含B-27 Supplement,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 元細(xì)胞樣

傳代特性 屬于終末分化細(xì)胞；屬于不增殖細(xì)胞群

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱,，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存,。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時(shí)取出爬片,。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次,，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：