兔骨髓樹(shù)突狀原代細(xì)胞 (未成熟DC細(xì)胞)公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞 小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞肉瘤細(xì)胞 英文名稱： DCS 人膀胱癌組織源細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒 人膀胱癌組織源細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基 100mL 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 大鼠原代心臟微血管周細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

實(shí)驗(yàn)室分離的兔骨髓未成熟DC采用密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,、培養(yǎng)過(guò)程添加細(xì)胞因子誘導(dǎo)而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的兔骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng)CD86免疫熒光鑒定,、細(xì)胞形態(tài)等綜合鑒定，純度可達(dá)80%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

兔骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞分離自骨髓；骨髓是機(jī)體的造血組織,，位于身體的許多骨骼內(nèi),。成年動(dòng)物的骨髓分兩種：紅骨髓和黃骨髓。紅骨髓能制造紅細(xì)胞,、血小板和各種白細(xì)胞,。血小板有止血作用，白細(xì)胞能殺滅與抑制各種病原體,，包括細(xì)菌,、病毒等；某些淋巴細(xì)胞能制造抗體,。因此,，骨髓不但是造血器官,，它還是重要的免疫器官。骨髓是存在于長(zhǎng)骨（如肱骨,、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀松骨質(zhì)間的網(wǎng)眼中,，是一種海綿狀的組織，能產(chǎn)生血細(xì)胞的骨髓略呈紅色,，稱為紅骨髓,。出生時(shí)，紅骨髓充滿全身骨髓腔,，隨著年齡增大,，脂肪細(xì)胞增多，相當(dāng)部分紅骨髓被黃骨髓取代,，后幾乎只有扁平骨骨髓腔中有紅骨髓,。骨髓DC細(xì)胞是由骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)而成的；樹(shù)突狀細(xì)胞分為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞和未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞,，典型的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞呈半貼壁生長(zhǎng),，在GM-CSF、IL4的作用下形成葡萄串樣集落,，細(xì)胞大而形態(tài)不規(guī)則,，表面皺褶多，亦可見(jiàn)少量短刺狀突,，胞內(nèi)細(xì)胞器豐富并可見(jiàn)吞噬泡,，具有較強(qiáng)的遷移能力，伴隨有部分未誘導(dǎo)成的單核細(xì)胞,，貼壁形態(tài)多樣,。而成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞由未成熟DC進(jìn)一步經(jīng)TNFα、LPS等誘導(dǎo)而成,，多數(shù)呈懸浮生長(zhǎng),， 細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大,，表面大量粗細(xì)不等的樹(shù)枝樣突起（高倍鏡或者電鏡下可觀察到 ）,，伴隨少量貼壁未成熟細(xì)胞或者單核細(xì)胞。未成熟DC細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)也可能導(dǎo)致自發(fā)分化成熟,。DC細(xì)胞尚無(wú)特異性細(xì)胞表面分子標(biāo)志,，主要通過(guò)形態(tài)學(xué)、組合性細(xì)胞表面標(biāo)志,、在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中能激活初始T細(xì)胞等特征進(jìn)行鑒定,。其中成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表面高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物（MHC）以及CD80、CD86等共刺激分子,，進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞,，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,，處于啟動(dòng)、調(diào)控,、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié),；未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗原攝取加工能力，但由于缺乏多種共刺激分子不能使初始T細(xì)胞活化,、增殖產(chǎn)生免疫應(yīng)答,，不能激活T細(xì)胞的第二信號(hào)，可導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能,，從而誘導(dǎo)免疫低反應(yīng)或抗原免疫特異性耐受,。未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表面CD80、CD86,、MHC-Ⅱ類分子等共刺激分子表達(dá)較低,，一般在30%以下。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS,、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：半貼壁半懸浮

細(xì)胞形態(tài)：圓形,、梭形,、多角形，形態(tài)多樣

傳代特性：屬于高度分化細(xì)胞,；屬于不增殖細(xì)胞群

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

兔骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞 (未成熟DC細(xì)胞)體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基,；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2,、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作步驟：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹(shù)膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：