兔附睪上皮原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代肝枯否細(xì)胞 小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞 英文名稱： MS1 人內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒 人內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基 100mL 淋巴內(nèi)皮細(xì)胞 人原代腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

實(shí)驗(yàn)室分離的兔附睪上皮采用膠原酶消化結(jié)合差速貼壁法制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實(shí)驗(yàn)室分離的兔附睪上皮經(jīng)PCK免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌等,。

 

細(xì)胞簡介：

兔附睪上皮細(xì)胞分離自附睪組織；附睪（Epididymis）是一個由曲折、細(xì)小的管子構(gòu)成的器官,，一端接著輸精管（Ductusdeferens）,，一端接著睪丸（Testis）的曲細(xì)精管，具體結(jié)構(gòu)主要包括輸出小管和附睪管,。附睪緊貼睪丸的上端和后緣,，可分為頭、體,、尾三部,。離開睪丸后通過輸出小管進(jìn)入附睪。附睪具有暫存精液并分泌附睪液營養(yǎng)的功能,，以促進(jìn)的進(jìn)一步成熟附睪的功能是暫存,，促進(jìn)的進(jìn)一步成熟。在附睪內(nèi)獲得運(yùn)動能力,，總共停留8～17天,，終達(dá)到功能上的成熟。在這個過程中,，除了自身的因素,，還受到附睪微環(huán)境的影響，這包括了一系列的物理,、化學(xué)變化和形態(tài)的改變,。可以說,，附睪微環(huán)境正常穩(wěn)定是附睪發(fā)揮促成熟這一功能的必要條件,。若附睪的功能發(fā)生異常，則不能成熟,，引起不育,。附睪上皮含有主細(xì)胞、基細(xì)胞,、亮細(xì)胞等幾種類型細(xì)胞,。基細(xì)胞,，其頂部離附睪管腔有一定距離,，在附睪各部分，其形態(tài)沒有差別,，一般認(rèn)為是貯備細(xì)胞,；另一種主細(xì)胞，是維持附睪生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ),，在各區(qū)段的主細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)差別很大,，這也反映出各區(qū)段的生理功能的差異,。除上皮細(xì)胞外，附睪的管壁組織結(jié)構(gòu)也有規(guī)律性的變化,，附睪管起始段平滑肌有自發(fā)地節(jié)律性收縮,，而尾部平滑肌就沒有這種特點(diǎn)，僅在射精一瞬間出現(xiàn)強(qiáng)烈的節(jié)律收縮,。作為負(fù)責(zé)提供適合成熟微環(huán)境的附睪,，具有活躍的分泌與吸收功能。其中,，附睪上皮的電解質(zhì)和水分的轉(zhuǎn)運(yùn),，對保持附睪內(nèi)合適的離子濃度和酸堿度，為成熟提供適宜的環(huán)境起著相當(dāng)重要的作用,。睪丸的支持細(xì)胞每天能產(chǎn)生大量睪網(wǎng)液,，如一只公羊每天約能分泌40毫升睪網(wǎng)液，而從附睪排出的只不過幾百微升,，也就是說睪丸分泌液有99%被附睪上皮重新吸收回體內(nèi),。動物實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)扎輸精管時睪丸不會腫脹,，但若結(jié)扎睪丸輸出小管,，睪丸第二天就會腫脹，這就充分證實(shí)了附睪存在著強(qiáng)有力的吸收功能,，但是重新吸收的意義尚不清楚,。體外培養(yǎng)附睪上皮細(xì)胞對的發(fā)育、成熟,，附睪生理基礎(chǔ)功能研究具有重要意義,。

培養(yǎng)信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基：含FBS、EGF,、Hydrocortisone,、腎上腺素、甲狀腺素,、Insulin、Transferrin,、Selenium Solution,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

兔附睪上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài),。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱,，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存,。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次，每次3min,。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜,，PBS沖洗3次,，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗,，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次,，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液,，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min,，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè),，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡,，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察。